不同浓度人参根总皂苷对蛴螬趋避率及保护酶活性的影响

刘广娜，王嘉辰，李欣诺，党永康，李海涛，王艳玲

(1.吉林农业科技学院中药学院，吉林 132101；2.梧州学院化学工程与资源再利用学院，梧州 543000)

人参(PanaxginsengC.A.Meyer.)为五加科人参属多年生草本植物[1]。人参中含有人参皂苷，可以健脑、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等，在人参中起着主要作用[2]。蛴螬为鞘翅目(Coleoptera)金龟甲科(Scarabaeidae)幼虫的总称，依靠进食土壤中的腐殖物、植物茎叶等维持生存。在生物体处于逆境情况下，即会激发昆虫体内存在的保护酶系统，被称作一个抗氧化系统，保护机体免受损伤[3]。本研究通过参考谭世强等[4]的载毒叶碟法，将人参根总皂苷作用于田间常见昆虫蛴螬，运用酶标仪测定其体内保护酶活性，研究人参皂苷对蛴螬的趋避效果及其体内保护酶活性，为新型植物源农药的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：3龄蛴螬，用新鲜土豆片饲养，备用。

供试试剂：人参根总皂苷(纯度80%)，购于上海源叶生物科技有限公司；1 000 μg·mL-1结晶牛血清白蛋白、0.15 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS，pH 7.0)、30 μmol·L-1乙二胺四乙酸二钠溶液、40 μmol·L-1核黄素溶液、2.25 mmol·L-1氮蓝四唑(NBT)溶液，均购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；CAT、POD、SOD活性测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；曲拉通，购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。

供试仪器：BS-1E恒温振荡培养箱，金坛市良友仪器有限公司；Hitachi×CT15E高速冷冻离心机，上海妙生科贸有限公司；Spectra Max Plus 384酶标仪，美谷分子仪器(上海)有限公司；Top Pette移液器，北京同德创业科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 趋避试验 参考谭世强等[4]载毒叶碟法，进行选择性拒食趋避试验。用1‰曲拉通将人参根总皂苷浓度分别配制成0、5、10、20、30、60 mg·mL-1，依次设为CK(对照)、T1、T2、T3、T4、T5。将土豆切片后，溶液浸泡3 s，取出，自然晾干，放于衬有湿滤纸的培养皿中，每皿1片处理、1片对照(CK)，设置3次重复。向每个培养皿中接3龄饥饿处理6 h的蛴螬20头，用黑膜封住皿口，扎若干小孔，室温避光饲养。于24、48 h后分别统计培养皿中两侧蛴螬数目，并计算选择性趋避率[5]。

选择性趋避率(%)=(C-T)/(C+T)×100。

式中，C为对照中蛴螬的数目，T为处理中蛴螬的数目。

1.2.2 试虫试验 釆用载毒叶碟法[4]。具体步骤同1.2.1趋避试验，不同之处为处理和对照不放于相同培养皿中，而是每个处理中仅含有处理的土豆片，每个处理3次重复。

1.2.3 酶源的制备 将处理24 h和48 h后的蛴螬取出，解剖取肠，用相应的酶提取液提取酶液，即为酶源，用于蛋白质含量及酶活力测定[6]。

1.2.4 蛋白质含量的测定[7](1) 标准曲线绘制。取1.5 mL离心管6支，按表1操作，摇匀，得到不同浓度的牛血清白蛋白稀释液。

表1 蛋白质含量标准曲线绘制加液含量

在96孔酶标板中，每孔依次加入上述稀释蛋白液5 μL(板中重复3次)，再加入200 μL考马斯亮蓝G-250试剂，放置5 min，在595 nm处测定OD值。以吸光度A 595 nm为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。见图1。

由图1可知，回归方程为y=0.000 3x+0.230 2，R2=0.990 6，将所测吸光度值的平均值作为y值，代入方程，可求出相应的x值，即为蛋白质浓度(μg·mL-1)。

(2)酶液蛋白质含量的测定。加样方法同标准曲线，不同的是对照每个孔加5 μL蒸馏水，样品每个孔加5 μL酶液。室温放置5 min，于595 nm处测定OD值，根据标准曲线计算酶液蛋白质浓度(μg·mL-1)。

1.2.5 蛴螬体内保护酶活性测定 过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)三种保护酶活性测定均按照试剂盒说明书进行。

1.3 数据分析

采用Excel 2017和SPSS 21.0软件进行数据统计和分析，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬趋避作用的影响

不同浓度人参根总皂苷对蛴螬趋避作用的影响见图2。由图2可知，不同浓度人参根总皂苷对3龄蛴螬作用48 h的选择性趋避率明显大于24 h趋避效果。人参根总皂苷的浓度为20 mg·mL-1处理48 h时趋避率达到最大值，为81.82%。表明人参根总皂苷对3龄蛴螬有明显的趋避作用，而且随着时间的推移，人参根总皂苷对蛴螬的趋避作用增强。

2.2 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内过氧化氢酶(CAT)活性的影响

不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内过氧化氢酶(CAT)活性的影响见图3。

由图3可知，不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内CAT酶活性处理48 h抑制效果弱于24 h；人参根总皂苷的浓度为30 mg·mL-1处理24 h时，CAT活性达到最低值。经过方差分析可知，处理24 h，不同浓度人参根总皂苷存在显著性差异，多重比较结果见表2所示。

表2 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内CAT活性的影响(24 h)

由表2可知，处理24 h，CK、T4处理与其它处理蛴螬体内CAT活性存在显著性差异，T1处理与T2、T5处理差异显著，T2、T3处理和T5处理差异不显著，T1和T3处理差异不显著。结果表明，人参根总皂苷浓度为30 mg·mL-1处理24 h，可有效抑制蛴螬体内的CAT活性。

2.3 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内过氧化物酶(POD)活性的影响

不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内过氧化物酶(POD)活性的影响见图4。由图4可知，不同浓度人参根总皂苷处理处理24 h，各处理POD活性均明显低于对照，且在人参根总皂苷浓度为10 mg·mL-1时，蛴螬体内POD活性最低。经过方差分析可知，处理24 h，不同浓度人参根总皂苷存在显著性差异，多重比较结果见表3所示。

表3 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内POD活性的影响(24 h)

由表3可知，处理24 h，CK、T1、T2处理与其它各浓度处理存在显著性差异；T3处理与T4、T5处理无显著性差异，T4处理与T5处理间无显著性差异。结果表明，人参根总皂苷浓度为10 mg·mL-1处理24 h，对蛴螬体内POD活性抑制效果最佳。

2.4 不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

不同浓度人参根总皂苷对蛴螬体内超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响见图5。由图5可知，不同浓度人参根总皂苷处理24 h，蛴螬体内SOD活性均低于对照，且浓度为10 mg·mL-1时活性最低；而处理48 h，蛴螬体内SOD活性抑制作用趋势不是很有规律。经过方差分析可知，处理24 h，不同浓度人参根总皂苷存在显著性差异，多重比较结果见表4所示。

由表4可知，T2处理与其它各浓度处理均存在显著性差异，T4处理与T3处理差异显著，CK与T2、T3存在显著性差异；而除以上处理外，其它处理差异不显著。结果表明，人参根总皂苷浓度为10 mg·mL-1处理24 h，对蛴螬体内的SOD活性抑制效果最佳。

3 结论与讨论

本研究通过分析蛴螬食用人参根总皂苷后体内的趋避率及保护酶活性的变化趋势，结果表明，人参根总皂苷浓度为20 mg·mL-1时，处理48 h，选择性趋避率达到最大值，为81.82%。抑制CAT、POD、SOD活性的处理时间均为24 h，而人参根总皂苷浓度分别为30、10 mg·mL-1和10 mg·mL-1。表明了人参根总皂苷很好抑制了蛴螬体内保护酶活性。

综上所述，人参根总皂苷可以有效趋避蛴螬并降低其体内的保护酶活性，从而抑制蛴螬对植株的破坏力和生存活力。鉴于实践成本、发挥药效时间等方面考虑，建议人参根总皂苷使用浓度为10 mg·mL-1，处理24 h防治蛴螬。本研究结果可为化学农药、生物农药、种植模式等方式综合防治蛴螬提供参考依据[8-10]。