刺五加对酒精戒断焦虑的作用及机制

赵容杰，王玉花，赵正林，李丽波，李 平，李成冲，刘洪凤，焦 宇

(齐齐哈尔医学院 1.精神卫生学院；2.医学技术学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.牡丹江医学院基础医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

改善酒精戒断焦虑症被认为治疗酒精依赖的重要途径[1]，但目前常用于治疗酒精依赖焦虑症的苯二氮卓类药物，因其本身可能具有成瘾性，其使用收到很大限制[2]。刺五加为五加科植物刺五加[Acanthopanax senticosus (Rupr.et Maxim.) Harms]的干燥根茎，不仅具有抗衰老、抗炎、提高机体免疫力等作用，还有保护中枢神经系统的作用，尤其表现出良好的抗焦虑作用[3]，并无成瘾性。

终纹床核(The bed nucleus of the stria terminalis,BNST)是介导酒精戒断焦虑症的重要的脑核团[4]。证据显示，在应激情况下，BNST的去加肾上腺素(Norepinephrine,NE)释放显著增多，这是引起烦躁不安和焦虑等情感障碍的重要机制[5]。同时，BNST的NE可刺激释放促肾上腺激素释放因子(Corticotropin releasing factor,CRF)引起CRF-ACTH-皮质酮(Coritosterone,CORT)应激激素反应轴的亢奋，也导致焦虑症[6]。因此，本研究先观察了刺五加的抗酒精戒断焦虑症的作用，后把BNST的NE-CORT通路为靶点探讨了作用机制。

1 材料与实验方法

1.1 实验动物与主要实验试剂仪器随机选取体重在230～250 g之间的40只雄性Sprague-Dawley大鼠，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。实验动物饲养在恒温恒湿的独立通气系统中，昼夜日光节律，室温(24±1) ℃，湿度45%～55%，实验期间饮食饮水自由。75%酒精(山东安捷高科消毒科技有限公司)，刺五加(根茎粉末，西安金萃坊植物技术开发有限公司)，大鼠CORT的ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，台式高速低温离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，旷场实验箱(上海欣软信息科技有限公司)，高架十字迷宫(上海欣软信息科技有限公司)，电子天平(德国赛多利斯公司)，高效液相色谱仪(美国Waters公司)，组织匀浆机(上海季诺科贸有限公司)。

1.2 实验分组与模型的建立待动物适应环境7 d后，采用随机分组的方法将动物分为5组，每组各8只，生理盐水对照组、酒精戒断模型组、刺五加低剂量(250 mg/kg)治疗组、刺五加高剂量(750 mg/kg)治疗组和刺五加高剂量对照组。模型组和两个刺五加治疗组，每天腹腔注射3 g/(kg·次)酒精(20%，vol/vol，在生理盐水溶解)，2 次/d，共7 d，随后终止酒精注射3 d，以此制备酒精戒断焦虑症模型；对照组注射等容积生理盐水。在酒精戒断期，灌胃刺五加治疗1 次/d，共3 d；对照组灌胃等容积自来水。第3天灌胃1 h后，各组大鼠分别先后在旷场测试箱和高架十字迷宫里测试其焦虑行为。行为学检测结束后，立即对所有动物施行安乐死，同时收集每只大鼠躯干血液，利用ELISA试剂盒检测血液中CORT浓度；同时，收集大脑选取BNST，利用高效液相色谱法检测BNST中NE的含量。

1.3 行为学测试

1.3.1 旷场实验 旷场测试箱，长宽高分别为50 cm×50 cm×50 cm，箱体主要由四周及箱底部的黑色有机材料及铝合金框架组成，箱顶盖为白色医用磨砂有机玻璃(长×宽：50 cm×50 cm)，正中心装有红外线摄像装置，用来观测并记录大鼠在自发活动箱中的运动轨迹及运动时间等指标。第3天灌胃结束1 h后，将大鼠放置于旷场实验箱的正中央，为避免误差，放置时均将大鼠头朝向箱体内部同一方向角落，开始记录5 min内大鼠的活动情况。实验室内光线昏暗并保持常亮，温度控制在(22±1)℃，保持实验室安静。每只大鼠检测后，对实验箱底部进行清洁处理，以消除气味对下一只大鼠的影响。观察指标为：大鼠5 min内在旷场实验箱中央区域的活动距离(单位：mm)及活动时间(单位：s)。

1.3.2 高架十字迷宫检测 迷宫整体由两个相对开放臂(长×宽：10 cm×50 cm)和两个相对闭合臂(长×宽：10 cm×50 cm)及四臂相交的中央区域(长×宽：10 cm×10 cm)构成，距离地面高度50 cm。实验过程中，保持实验环境稳定并保持安静。将大鼠置于迷宫中央区域，且所有大鼠头朝向一致，均朝向开臂方向，每只大鼠检测时间5 min。大鼠检测后需清洁迷宫，消除对下一只大鼠的影响。观察指标：大鼠进入开放臂进入次数百分比：进入开放臂次数/(进入开放臂次数+进入闭合臂次数)； 在开放臂逗留时间百分比：开放臂时间/(开放臂时间+闭合臂时间)。

1.4 血浆中CORT的含量测定在大鼠行为学检测结束后，利用含有20 μL EDTA (20 mg/mL)的离心管收集大鼠血液(大鼠迅速乙醚麻醉后断头，流出的躯干血液)约1 mL，后在4 ℃条件下1500 g离心15 min，随后收集血浆，利用ELISA试剂盒检测CORT水平，结果以ng/mL表示。

1.5 BNST中NE的含量测定行为学测试完成后，立即处死大鼠，断头取大大脑。将脑放置冰盘中央，利用脑模具，根据George Paxinos和Charles Watson编写的大鼠脑定位图谱，精确取出BNST，立即储存在-80 ℃超低温冰箱内备用。精密称取NE标准品约5 mg，用2% 高氯酸溶解并定容到5 mL容量瓶作为对照品贮备液(NE浓度：1 mg/mL)。精密吸取贮备液，进行梯度稀释成最终浓度0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的NE标准品梯度样品，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得出回归方程。取出-80 ℃超低温冰箱冻存的BNST称重，在样品中加入4 ℃保存的2%高氯酸处理液0.1 g/mL，放置于冰水混合物中用微型匀浆机充分匀浆。将上述物质放入离心机中，以15000 g离心30 min，吸取上清液。取上清液以0.22 μm的微孔滤膜过滤。利用超高效液相色谱进行检测。色谱条件：色谱柱为Cosmosil-2.6 Cl8(2.1 ID×150 mm)，流动相为甲醇:0.1%甲酸=5:95等度洗脱，流速为0.3 mL/min，室温20 ℃，波长254 nm，样品中各主要组分用外标法进行定量[7]。

1.6 数据统计计量资料以“均数±标准差”表示，并利用GraphPad Prism 6.0软件进行单因素方差分析和Newman-Keuls组间比较。在方差分析前，对数据进行了正态分布和方差齐性检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 刺五加对大鼠行为学的影响大鼠在旷场中央区的活动距离和时间与其焦虑程度负相关。

旷场实验结果显示，与生理盐水对照组相比，酒精戒断模型组大鼠在旷场中央区域活动度明显降低：刺五加低剂量和高剂量治疗分别改善这些大鼠焦虑行为指标，但治疗效应没表现出剂量依赖性。另外，在刺五加高剂量对照组没有发现大鼠的中央区活动度发生改变(P>0.05)，见表1。

表1 刺五加对酒精戒断大鼠旷场实验的影响

在高架十字迷宫行为测试中发现，与生理盐水对照组相比，酒精戒断模型组大鼠的开臂进入次数和开臂滞留时间均显著减少，而刺五加低剂量和高剂量治疗均能够显著提高大鼠在开放臂的探索性,见表2。

表2 刺五加对酒精戒断大鼠高架十字迷宫实验的影响

2.2 刺五加对血浆CORT浓度的影响ELISA检测结果显示，与生理盐水对照组组相比较，酒精戒断模型组大鼠血浆CORT含量显著升高(P<0.001)，说明酒精戒断引起了焦虑；但刺五加低剂量和高剂量治疗明显抑制CORT的浓度升高,见表3。

表3 各组大鼠血浆皮质酮检测结果

2.3 刺五加对BNST中NE含量的影响

2.3.1 高效液相色谱法标准曲线 以浓度为0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的NE标准品浓度，绘制标准曲线，进行线性回归分析。如图1所示，NE标准品的线性回归方程为 y=1874.9x-1723.1(r2=0.995)，NE浓度在0.39～100 μg/mL范围内，线性关系良好，可用于定量分析BNST中NE的含量。

图1 NE标准品的标准曲线

2.3.2 高效液相色谱法检测BNST中NE的含量 BNST的NE含量被认为与焦虑程度正相关。高效液相检测结果显示，与生理盐水对照组相比，酒精戒断模型组大鼠BNST的NE含量显著增高(P<0.001)，但刺五加低剂量和高剂量治疗明显抑制此NE的增高。仅给予刺五加没有引起BNST的NE含量改变,见表4。

表4 刺五加对大鼠终纹床核中NE含量的影响

3 讨论

在本实验研究中，我们观察到，刺五加低剂量(250 mg/kg)和高剂量(750 mg/kg)治疗改善了酒精戒断大鼠在行为学测试中的焦虑行为改变，抑制了酒精戒断焦虑大鼠在血液中的代表应激激素CORT的水平升高。同时，在高效液相色谱法检测中，我们还发现，刺五加治疗降低了酒精戒断引起的大鼠BNST的NE含量增多。这些结果表明，在酒精戒断期给予刺五加治疗，可以缓解和阻断大鼠酒精戒断焦虑症，且此作用很可能通过抑制BNST的NE-(CRF-ACTH)-CORT应激反应轴所介导。

啮齿类包括大鼠，在酒精戒断期出现明显的焦虑症。这些焦虑症在旷场和高架十字迷宫行为测试中，在旷场中央区大鼠步行距离和停留时间的显著缩短[8]；在高架十字迷宫测试中表现为大鼠在开放臂的访问次数和逗留时间百分比的明显减少[9]。尽管如此，在酒精戒断期灌胃低、高剂量刺五加的大鼠，这些焦虑行为被明显地抑制了。虽然 刺五加的这种抗焦虑效应在统计学上没有呈现剂量依赖性，但随着剂量增加其效应增强的趋势比较明显。已知，大鼠焦虑症的发生与血液中应激激素水平呈正相关即，血液中的CORT水平高为焦虑症的重要生物标记[10]。在本研究中，ELISA检测发现，在酒精戒断焦虑症大鼠血浆中CORT浓度明显增高，但刺五加两个剂量治疗把酒精大鼠血液中的CORT几乎恢复到正常水平。这个ELISA结果，从激素水平支持了刺五加的抗酒精戒断焦虑症的作用，也显示刺五加对应激激素反应轴的调节是其抗焦虑作用的神经内分泌学基础。

NE-CRF-ACTH-CORT是机体最重要的神经内分泌应激反应轴之一。CRF从大脑的含有CRF的神经元(又称CRF能神经元)分泌，引起应激激素反应轴的启动[11]。神经解剖组织学研究发现，在脑内CRF能神经元主要分布在以下脑区即，下丘脑、杏仁核、伏隔核、海马和BNST等[12]。其中，BNST的CRF能神经元在焦虑症的发生发展中起着重要作用。因此，在BNST，CRF与NE一起被称为“致焦虑因子”。在BNST，NE直接或间接地通过刺激CRF的释放介导焦虑症的发生[13]。本研究中，高效液相色谱法分析发现，酒精戒断焦虑症大鼠BNST的NE水平明显升高，又一次证明NE的合成和分泌增多是酒精戒断焦虑症的神经递质学基础。同时，本研究还发现，刺五加低、高剂量在戒断期的治疗抑制了BNST的NE浓度的升高。这个结果与行为学测试和激素检测结果一致，表明刺五加通过改善BNST的NE能神经传递治疗大鼠酒精戒断焦虑症。

芮施等人报告了刺五加根皮提取物通过改善小鼠脑中五羟色胺和GABA神经传递提高戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠质量的实验结果[14]；张倩等研究者发现，刺五加苷B通过调节大脑谷氨酸能神经和GABA能神经的传递改善疲劳小鼠学习记忆能力[15]。这些研究间接地支持了本研究的实验结果即，刺五加调节酒精戒断所致BNST的NE神经传递亢进，而治疗大鼠酒精戒断焦虑症。

综上所述，本研究观察和证明了刺五加对酒精戒断焦虑症的治疗作用，揭示了刺五加通过BNST的NE(-CRF-ACTH-)-CORT通路起到抗焦虑作用的机制。本项目研究为刺五加可能开发成治疗酒精戒断焦虑症乃至酒精依赖的治疗药提供了有力的实验依据。