miRNA-21对2型糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化的影响

白雨鑫，孙立新，刘 勇，李欣欣，吴 琦，郭素芬，潘艳明，成永霞

(牡丹江医学院基础医学院病理学与病理生理学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)是发生于糖尿病患者但不能用冠心病等器质性病因解释的一种心肌病变[1]，主要表现为心肌结构紊乱，心功能障碍甚至出现心力衰竭。近年来对DCM的发病机制有较为深入的研究，通过查阅文献得知miRNA-21对于心血管系统疾病会产生一定的影响，并发现抑制miRNA-21 表达对心肌损伤具有一定的保护作用[2]。同时，心肌纤维化做为糖尿病性心肌病的主要病理表现[3]，愈来愈引发关注，因此，本实验将立足于观察miRNA-21对糖尿病心肌纤维化的影响，对糖尿病性心肌病的发病机制进行深入探究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取6周龄SPF级SD大鼠，共32只，体重(180±20)g，购自辽宁长生生物有限公司，动物饲养于牡丹江医学院医药研究中心SPF级动物房，自由摄取饲料和水，12 h昼夜交替照明。本实验已经通过牡丹江医学院动物伦理委员会审查并获得批准。

1.1.2 实验试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司(美国)；高脂高糖饲料(酪蛋白、玉米淀粉、玉米糊精、糖、纤维素、豆油等)；由小黍有泰(北京)生物科技有限公司加工制备；SPF级大鼠维持饲料由辽宁长生生物技术股份有限公司加工制备；逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR试剂盒购自锐博生物科技有限公司；改良Masson三色染色液购自北京索莱宝科技有限公司；α-SMA单克隆抗体购自碧云天生物技术公司；miRNA-21慢病毒购自沈阳万类生物科技有限公司；血糖测试仪和血糖试纸购于上海罗氏公司；包埋机、切片机来自Leica 公司(德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立 32只SD大鼠自由摄取食物和水，适应性喂养1周。对大鼠进行随机分组，分为对照组，DCM组、DCM+干扰miRNA-21组、DCM+干扰对照组，每组8只。对照组大鼠普通维持饲料喂养，而DCM组、DCM+干扰miRNA-21组、DCM+干扰对照组分别进行高糖高脂饲料喂养。喂养4周后，给予DCM组、DCM+干扰miRNA-21组、DCM+干扰对照组单次腹腔注射溶解于柠檬酸钠缓冲液的链脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，其中有4只大鼠注射2次，而对照组大鼠注射等剂量的柠檬酸钠缓冲液。72 h后对各组大鼠进行空腹血糖测量，空腹血糖≥11.1 mmol/L 提示2型糖尿病建模成功。第8周进行慢病毒转染，DCM+干扰miRNA-21组大鼠经尾静脉注射1×108TU/mL干扰miRNA-21慢病毒，而DCM+干扰对照组经尾静脉注射1×108TU/mL的对照慢病毒，每只大鼠单次注射200 L(转染周期4周)。第12周所有试验用鼠处死取材。

1.2.2 血糖和体重的测量 注射STZ 72 h后，各组大鼠禁食不禁水12 h后经尾静脉采血利用血糖仪进行测量，之后每2周对各组大鼠进行体重和空腹血糖测量并记录。

1.2.3 qRT-PCR 取50 mg大鼠心肌组织加入TRIzol裂解液，以氯仿-异丙醇体系提取样品总RNA，经微量核酸仪检测其纯度和浓度，根据miR-21逆转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA模板，混入SYBR Green qPCR Mix 进行qRT-PCR检测。miR-21的上游引物5′- GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物5'-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′；内参基因 U6 上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，内参基因 U6 下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。参数设置：95 ℃，10 min循环1次，95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，70 ℃10 s，共40个循环，采用2-△△CT法进行计算。

1.2.4 HE染色 心肌组织放置在4%多聚甲醛固定72 h，石蜡包埋，切片5 μm。脱蜡，常规逆梯度乙醇脱水，苏木素-伊红染色，再次顺梯度乙醇浸泡，中性树胶封固,显微镜下观察并拍照。

1.2.5 Masson染色 心肌组织常规脱水，包埋切片5 μm，烘片4 h，常规乙醇脱水并清洗，根据 Masson试剂盒说明依次加入各溶液，最后中性树胶封固,显微镜下观察并选取不同视野拍照。利用Image J图像分析系统计算胶原纤维面积百分率=胶原面积/总面积。

1.2.6 免疫组织化学 心肌组织包埋，切片5 μm并脱蜡，常规乙醇脱水并清洗，进行抗原修复，封闭液封闭后，进行一抗孵育过夜，滴加二抗，清洗后苏木素染色，封片并显微镜下观察；通过Image J图像分析系统进行分析；阳性面积百分率=褐色颗粒面积/总面积。

1.3 统计学方法实验数据采用SPSS 25.0软件进行分析，计量资料采用“均数±标准差”表示，多个组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况对照组大鼠饮水量和进食量正常，排便排尿量正常，毛发顺有光泽，精神状态较好。模型组大鼠进食量多，饮水量增加，后期尿量逐渐增加且尿中带有强烈的酮味，毛发竖起呈暗黄色，状态较差。与对照组相比，DCM组、DCM+干扰miRNA-21组、DCM+干扰对照组大鼠在高脂饮食4周时出现了明显的腹型肥胖(图1)。

图1 对照组与模型组大鼠腹部外观

对照组大鼠体重随着时间变化稳定增长，DCM组大鼠体重前期增长较快，随着病情的进展体重有所降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。与DCM组相比，DCM+干扰对照组的体重差异不明显(P>0.05)，差异无统计学意义。而与DCM+干扰对照组相比，DCM+干扰miRNA-21组的大鼠体重在转染后体重有所上升(P<0.05)，差异有统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠体重变化情况

2.2 各组大鼠血糖监测结果对照组大鼠空腹血糖维持稳定且均在正常血糖范围(3.9～6.1 mmol/L)，DCM组大鼠与对照组相比，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且空腹血糖维持在较高的水平，P<0.05有统计学意义。与DCM组相比，DCM+干扰对照组无明显差异(P>0.05)，而与DCM+干扰对照组相比，DCM+干扰miRNA-21组空腹血糖水平在转染后有所下降，P<0.05有统计学意义(表2)。

表2 各组大鼠空腹血糖水平比较

2.3 各组大鼠qRT-PCR结果与对照组相比，DCM组和DCM+干扰对照组心肌组织中miRNA-21的表达量增加(P<0.001)，而DCM+干扰对照组相比，DCM+干扰miRNA-21组表达有所下降(P<0.001)，以上结果说明DCM组大鼠心肌组织中miRNA-21的表达升高，并且说明DCM+干扰miRNA-21组转染成功(表3)。

表3 各组大鼠心肌miR-21表达情况比较

2.4 各组大鼠HE染色结果对照组大鼠中，8只大鼠均表现心肌细胞纤维排列整齐，胞质胞核染色均匀，结构完整清晰；而在DCM组大鼠中，有6只大鼠的心肌细胞出现排列不整齐，细胞质深染，局部心肌纤维出现断裂，心肌细胞间有炎细胞浸润，其余两2只表现不明显。在DCM+干扰对照组中8只大鼠均出现了心肌纤维断裂等表现，但与DCM组大鼠无明显差别，而在DCM+干扰miRNA-21组大鼠中，有7只大鼠心肌细胞损伤程度有所改善，间质的炎性细胞也有所减少(图2)。

图2 各组大鼠心肌组织的HE染色结果(×200)

2.5 各组大鼠Masson染色结果在Masson染色中心肌纤维表现为红色而胶原纤维表现为蓝色；对照组大鼠的心肌组织中均表现为仅有少量的蓝色胶原纤维且分布均匀，而8只DCM组大鼠的心肌组织中，胶原纤维表达量均明显升高，且主要表现血管周围并向有所蔓延(P<0.05)。与对照组相比，有7只DCM+干扰对照组大鼠心肌组织中胶原纤维表达量升高(P<0.05)，但与DCM组相比无统计学差异。与DCM+干扰对照组比较，有7只干扰miRNA-21表达的大鼠心肌胶原纤维沉积有所改善，胶原纤维表达量下降(P<0.05)(图3、表4)。

图3 各组大鼠心肌组织的Masson染色结果(×200)

表4 各组大鼠心肌组织胶原纤维表达量

2.6 各组大鼠免疫组化结果在正常组大鼠心肌组织中，α-SMA表达量较低，而与对照组相比，在DCM组大鼠心肌组织中，α-SMA表达水平显著升高(P<0.05)，主要集中表现在心肌间质和少量血管周围，DCM+干扰miRNA-21组心肌组织中α-SMA表达量相比DCM+干扰对照组降低(P<0.05)。说明2型糖尿病心肌病大鼠会出现α-SMA的沉积，进一步降低miRNA-21的表达会减少α-SMA的产生(图4、表5)。

图4 免疫组化染色检测心肌组织中α-SMA的表达情况(×400)

表5 各组大鼠心肌组织α-SMA蛋白定量分析

3 讨论

糖尿病是一种代谢性疾病，临床表现为持续性高血糖、体重减轻、多饮等，随着病情的加重会表现为微血管并发症，包括肾脏、视网膜、肝脏、心脏等器官损伤[4]。近年来研究发现糖尿病微血管并发症进展迅速并引发一系列不可逆性的损伤，合并心血管系统并发症的糖尿病患者致死率增加2倍以上[5]。DCM发病不依赖于高血压、冠状动脉疾病和其他已知心脏疾病，主要表现为心肌细胞肥大、心肌间质胶原沉积和心肌纤维化，其中心肌纤维化可致心肌僵硬度增加、心室舒张功能减退、冠状动脉储备下降，甚至引发猝死[6-7]。鉴于以上严重后果，糖尿病性心肌纤维化已引起国内外学者广泛重视，对心肌纤维化治疗方法的研究也日益深入。

研究发现miRNA-21参与心脏、肾脏、肝脏等多个器官纤维化的发生发展[8-10]，Liu等[11]发现糖尿病小鼠的肾小球系膜细胞中miRNA-21表达升高，引起胶原纤维大量堆积，最终进展为肾间质纤维化。Yuan[12]等发现miR-21通过靶向Smad 7促进心肌梗死后的心肌纤维化。miRNA-21是否影响糖尿病大鼠心肌纤维化的发生发展目前尚不明确。本实验通过喂养高糖高脂饲料之后进行腹腔注射STZ从而建立2型糖尿病模型，结果发现与对照组大鼠相比，DCM组大鼠前期体重增长之后出现体重下降趋势并且空腹血糖升高；与DCM组相比，DCM+干扰miRNA-21组大鼠在转染后体重有所增加，空腹血糖水平下降，说明抑制miRNA-21对2型糖尿病大鼠的体重和空腹血糖有一定的影响。通过心肌组织病理学染色进一步观察糖尿病心肌纤维化，观察得到DCM大鼠心肌结构排列紊乱，心肌细胞变性坏死，出现心肌细胞间质胶原纤维堆积；而降低miRNA-21的表达后减轻心肌细胞的损伤以及胶原纤维的产生，从而改善糖尿病心肌纤维化。在免疫组化中观察到降低miRNA-21的表达可以减少心肌间质中α-SMA的合成及沉积，进而抑制DCM的进一步发展。

综上所述，抑制miRNA-21表达可以减轻心肌细胞损伤，从而延缓DCM心肌纤维化的进展，以上结果为DCM的机制探讨及其纤维化的临床治疗提供了新的思路和方向。