LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖、侵袭的影响及机制

范竞文，方 超，李婉玉，任春慧，冯 晨，冯 华

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性生殖系统中致死率最高的恶性肿瘤[1]。发病早期隐匿，缺乏典型的临床症状和有效的筛查与诊断方法，约70%患者初诊时已处于晚期[2]。顺铂作为卵巢癌临床治疗的一线用药，在卵巢癌的化疗中发挥了重要的作用，大多数卵巢癌患者起初对顺铂敏感，但是最终常发展为耐药[3-4]。因此寻找有效的的途径增强卵巢癌对顺铂的敏感性，抑制其耐药并探讨其分子机制，成为研究的热点。PI3K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)信号转导通路被认为是肿瘤细胞存活和介导其耐药的关键通路，相关研究表明LY294002(PI3K泛抑制剂)可以增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗作用[5-7]。但目前对LY294002联合顺铂对卵巢癌增殖和侵袭影响的具体机制研究甚少。因此本研究旨在观察LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞增殖、侵袭的影响，并以PI3K/AKT通路为靶点，探讨其作用机制，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3由哈尔滨医科大学病理教研室馈赠。

1.1.2 主要试剂 LY294002购自MCE公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Biosharp公司；顺铂、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒购自meilunbio公司；β-actin、MMP2、MMP9、AKT抗体购自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A2780和SKOV3细胞常规培养于5% CO2、37 ℃培养箱中，用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI-1640的培养基培养，2～3 d换液，待细胞融合度达80%～90%时用0.25%胰酶进行消化、传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 CCK-8测定细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后离心，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基稀释成单细胞悬液，接种到96孔板中，调整细胞浓度至8000个/孔，每孔加入RPMI1640培养液100 μL，并设置空白对照。培养24 h后弃去原培养液，每孔加入不同浓度的LY294002(10、20、40、60 μmol/L)和顺铂(5、15、25、40 μmol/L)100 μL含药培养液，每个浓度设5个复孔；无细胞孔加入不含药物的培养液。继续培养24 h后弃去原培养液，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的RPMI1640培养基100 μL，继续培养2 h后，用酶标仪检测450 nm下各孔的OD值。计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=1-(OD实验组-OD空白对照组)/(OD正常对照组-OD空白对照组)×100%。用Graphpad prism 8.0计算IC50(半数抑制浓度)值并绘制细胞增殖抑制曲线。

1.2.3 细胞划痕实验测定迁移能力 取对数生长期的A2780和SKOV3细胞，将细胞接种到6孔板中，每孔含有6×105个细胞，培养24 h后每孔垂直于6孔板划3条平行线，然后用PBS洗去脱落细胞，加入无血清培养液，根据CCK-8所测两种细胞对于两种药物的IC50值确定加药浓度后分组，分为正常对照组、LY294002组(20 μmol/L)、顺铂组(10 μmol/L)、LY294002+顺铂组(20 μmol/L+10 μmol/L)。最后将所有细胞放入含5% CO2，37 ℃的培养箱中，分别记录干预24 h、48 h后的细胞划痕愈合情况，用Image J软件进行相关分析。

1.2.4 Western Blot 收集各组细胞样本，加入RIPA液裂解，于4 ℃、12000 r/min条件下离心15 min，取上清液为细胞蛋白检测样本，BCA法测定总蛋白含量。配制10%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，蛋白上样跑电泳，分离后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入稀释后的一抗(β-catin 1:2000、MMP2 1:800、MMP9 1:800、AKT 1:1000)4 ℃冰箱孵育过夜，用TBST液漂洗3次，每次5 min；加入二抗室温抚育1 h，再用TBST液漂洗3次，每次5 min，ECL显影。每个样本重复3次。应用Image J软件分析条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析并用Graphpad prism 8.0作图。符合正态分布的计量资料以“均数±标准差”表示，多组间数据的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002和顺铂对卵巢癌A2780、SKOV3细胞增殖的影响结果表明，LY294002和顺铂对细胞增殖的抑制作用随着药物浓度升高而增加，并且呈剂量依赖性，当LY294002浓度在30 μmol/L时对两种细胞均有明显的抑制作用，而后随药物浓度的增加对A2780细胞的抑制作用要强于SKOV3细胞。当顺铂浓度在15 μmol/L时对两种细胞均有明显的抑制作用，超过20 μmol/L时，对A2780细胞的抑制率明显高于SKOV3细胞。LY294002和顺铂对A2780、SKOV3细胞的增殖抑制率见图1。

图1 不同浓度的LY294002和顺铂对A2780和SKOV3细胞增殖的抑制作用

2.2 LY294002和顺铂对A2780、SKOV3细胞迁移的影响结果表明，划痕24 h后，与对照组相比，A2780和SKOV3细胞的LY294002组、顺铂组及LY294002+顺铂组迁移面积显著减小(P<0.01)，与LY294002组或顺铂组相比，LY294002+顺铂组A2780、SKOV3细胞迁移距离均显著减小，差异有统计学意义(P<0.01)；划痕48 h后，划痕面积明显缩小，差异有统计学意义(P<0.01)，效果比24 h更明显。各组A2780、SKOV3细胞迁移面积见图2、图3。

图2 各组A2780细胞划痕实验结果(×10)

图3 各组SKOV3细胞划痕实验结果(×10)

2.3 LY294002联合顺铂对A2780、SKOV3细胞MMP2、MMP9蛋白表达的影响结果表明，与对照组相比，LY294002组、顺铂组及LY294002+顺铂组A2780、SKOV3细胞MMP2、MMP9的蛋白表达水平均较正常对照组降低(P<0.05)；同时，与LY294002组或顺铂组单独用药相比，LY294002+顺铂组A2780、SKOV3细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。各组A2780、SKOV3细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平见图4、图5。

2.4 LY294002联合顺铂对A2780、SKOV3细胞AKT蛋白表达水平的影响结果表明，与对照组相比，LY294002组、顺铂组及LY294002联合顺铂组A2780、SKOV3细胞AKT水平均显著降低(P<0.05)，同时，与LY294002组或顺铂组相比，LY294002+顺铂组A2780、SKOV3细胞AKT水平显著降低(P<0.05)，各组A2780、SKOV3细胞AKT蛋白表达水平见图4、图5。

图4 各A2780细胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表达水平

图5 各组SKOV3细胞MMP2、MMP9及AKT的蛋白表达水平

3 讨论

卵巢癌为女性生殖系统第一致死率的恶性肿瘤，发病率居妇科恶性肿瘤的第3位，仅次于子宫内膜癌和子宫颈癌，由于缺乏有效的早期筛查及诊断方法，超过70%的卵巢癌患者一经诊断已处于晚期[8]。虽然很多晚期患者最初受益于满意的肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗，但近90%的患者仍会复发，并最终导致死亡[9-10]。虽然最初铂类(顺铂/卡铂) 联合紫杉醇化疗对大约80%的患者有效，但卵巢癌的治疗难点在于其侵袭性强以及易产生耐药性，后期易复发，迫使患者进行全部化疗疗程，不但治疗效果欠佳，同时会出现严重的不良反应。在这种情况下急需一种新的联合治疗策略来提高晚期卵巢癌的临床疗效。与此同时，阐明卵巢癌的迁移、侵袭及转移机制，对于临床上寻找敏感的诊断指标及基因治疗靶点，从而提高卵巢癌患者的生存期无疑具有极其重要的意义[11]。

PI3K/AKT/mTOR信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，参与很多重要的生物学过程的调控，有报道指出PI3K/AKT/mTOR信号通路在卵巢癌中的增殖、侵袭、细胞周期进程、血管形成及耐药中发挥着重要的作用，因而PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂成为卵巢癌治疗新方向。因此本研究选用PI3K抑制剂LY294002联合顺铂作用于卵巢癌细胞，探讨其联合应用能否增强顺铂的化疗效果，抑制肿瘤的增殖、侵袭和迁移。

本研究从不同浓度药物LY294002和顺铂作用人卵巢癌A2780和SKOV3细胞，观察对增殖抑制效果，结果发现，LY294002和顺铂均对细胞增殖有明显的抑制作用，随着药物浓度升高而增加呈剂量依赖性。恶性肿瘤难治的原因之一就是肿瘤细胞的迁移侵袭造成体内转移，为肿瘤治疗造成很大阻碍，本研究在明确LY294002和顺铂抑制增殖效果的基础上，通过划痕实验验发现划痕24 h后，LY294002联合顺铂迁移面积显著减小，划痕48 h后，划痕面积明显缩小，效果比24 h更明显。与单独用药相比，LY294002联合顺铂可降低A2780、SKOV3细胞MMP2、MMP9蛋白表达水平。表明LY294002可促进顺铂抑制A2780和SKOV3 细胞的迁移和侵袭。AKT是PI3K/AKT信号通路中主要的下游效应靶基因，对细胞生存、细胞周期进程，细胞生长，新陈代谢有很大的影响。因此，抑制PI3K/AKT通路可以阻止肿瘤细胞的生长或发展。本研究发现，与LY294002组或顺铂组相比，LY294002联合顺铂可显著降低A2780和SKOV3细胞AKT水平，说明顺铂抑制A2780和SKOV3细胞增殖、侵袭作用与调控PI3K/AKT通路有关。

本研究尚存在一定的局限性，目前仅在细胞水平证实了顺铂和LY294002对卵巢癌的作用，但尚未在动物模型中深入研究其作用和相关机制，且具体治疗效果还有待于临床评估。我们可以在未来不断优化靶向药物的联合治疗，使不同作用机制的药物配合使用，在最大程度上发挥协同抗肿瘤作用，实现多选择性的个体化分子靶向治疗[12]。

综上所述，LY294002和顺铂能协同抑制人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3的增殖和侵袭，顺铂联合LY294002协同抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路来实现。本研究为卵巢癌治疗方式的选择提供新的理论依据。但其更多潜在的抗肿瘤机制有待进一步深入研究。