TUSC3基因表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响

刘佳奇，杨 爽,宋 洁，卜晓波

(牡丹江医学院生物教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

TUSC3(tumor suppressor candidate gene 3)，在过去数年中曾被命名为M33、N33等。该基因位于8号染色体短臂2区2带(8p22)，8号染色体全长146.364 Mb，包含1198个基因，是一个比较典型的高重复含量和高节段重复程度的染色体[1-2]。在之前的研究中我们发现TUSC3在乳腺癌组织和乳腺癌旁组织中存在差异表达，并对乳腺癌细胞的增殖能力产生了影响，分析实验结果提示该基因在乳腺癌中可能发挥抑癌作用[3]。本研究在此基础上，通过划痕实验和Transwell实验分别检测了TUSC3表达水平不同时的乳腺癌细胞的运动能力和侵袭能力。通过Western blot 实验检测TUSC3表达水平不同的乳腺癌细胞中E-cadherin、Vimentin的表达，分析结果的相关性，为下一步实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织材料乳腺癌细胞株MDA-MB-231(来自牡丹江医学院病理教研室)；正常乳腺组织蛋白MCF-10A及乳腺癌细胞株MCF-7(来自哈尔滨医科大学)。

1.2 主要试剂TUSC3兔抗人单克隆抗体(宝泰克生物科技有限公司，产品编号ABIN3185751)、TUSC3过表达质粒(苏州吉玛基因股份有限公司)、TUSC3 siRNA(广州锐博生物科技有限公司)、Lipo200转染试剂(广州锐博生物科技有限公司)，Tranwsell试剂盒(宝泰克生物科技有限公司)，Vimentin 、E-cadherin抗体(中国中杉金桥)。

1.3 操作方法

1.3.1 转染细胞系建立 将处于对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7分别接种在6孔板中。分别通过TUSC3 si-RNA建立TUSC3低表达细胞系(MDA-MB-231)及对照组(TUSC3-siRNA；Scrambled-siRNA)，通过TUSC3过表达质粒建立TUSC3过表达细胞系(MCF-7)及对照组(pcDNA3.1-TUSC3；pcDNA3.1-NC)，每组设3个复孔。

1.3.2 划痕实验 用200 μL移液管尖端轻轻刮擦细胞，然后PBS洗涤。使用光学显微镜在0 h、48 h分别获得图像，并记录划痕面积(S1、S2)，细胞迁移率(%)=(S1-S2)/S1×100%，每组实验重复3次。

1.3.3 Transwell实验 将配置好的Matrigel胶加入Transwell小室装置的上室底部，凝固后，将重悬好的细胞以1×104浓度接种于上室中，在上室和下室分别加入200 μL无血清DMEM和600 μL含有10%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2培养箱常规培养14～16 h。将下面侵入的细胞使用甲醛固定，0.1%结晶紫染色20 min。使用光学显微镜取三个不同视野拍照，计数穿至膜下层的细胞数，取平均值，每组实验重复3次。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件分析数据，计量资料用“均数±标准差”表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUSC3高/低表达对乳腺癌细胞迁移能力的影响转染后，乳腺癌细胞的运动能力因TUSC3的表达不同而发生变化，见图1。与对照组比较，敲除MDA-MB-231细胞中TUSC3后的细胞迁移率增高(P<0.0001)，与对照组比较，使MCF-7细胞中TUSC3过表达后，细胞迁移率下降(P<0.0001)，差异有统计学意义。

图1 划痕实验检测处理后细胞迁移能力

2.2 TUSC3高/低表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响与对照组比较，在MDA-MB-231细胞中，敲减TUSC3表达后，穿膜细胞计数明显高于对照组，提示细胞侵袭能力上升(P=0.0055)；与对照组比较，在MCF-7细胞中，过表达TUSC3后，穿膜细胞计数明显低于对照组，提示细胞侵袭能力下降(P=0.0023)，见图2。

图2 侵袭实验检测处理后细胞侵袭能力

2.3 敲减TUSC3表达促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭与EMT相关通过Western blot实验检测乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7在分别敲减、过表达后，E-cadherin和vimentin的表达。结果提示，在MDA-MB-231细胞中，与对照组相比，当敲减TUSC3表达时，E-钙粘蛋白表达下降(P<0.05)，波形蛋白上升(P<0.05)，提示与EMT相关。在MCF-7细胞中，与对照组相比，当TUSC3在细胞中过表达时，E-钙粘蛋白表达下降(P>0.05),未见统计学意义，波形蛋白下降(P<0.05)，见图3。

图3 Western blot检测处理后细胞中E-cadherin、Vimentin表达

3 讨论

TUSC3以8号染色体短臂2区2带的短臂缺失，基因异常甲基化等形式在许多癌症(前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、大肠癌[6])的发生和发展中发挥不同作用。在之前的研究中我们通过免疫组化和Western Blot实验发现TUSC3在乳腺癌组织中表达低于乳腺癌旁组织。我们选择了两个乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MCF-7)根据该细胞系中TUSC3的表达情况，通过使用siRNA和过表达质粒分别建立了TUSC3高/低表达的乳腺癌细胞系，实验结果发现，干扰TUSC3的表达后，乳腺癌细胞的增殖能力产生了变化[3]。

乳腺癌高死亡率的主要原因是其发生了迁移和侵袭。因此，我们通过划痕实验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验观察干扰TUSC3表达后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果显示，过表达TUSC3后，乳腺癌细胞的划痕闭合率与空质粒转染的对照组相比更低，穿膜细胞数也更少，提示迁移能力和侵袭能力受到了抑制。敲减TUSC3的表达后，乳腺癌细胞的划痕闭合率与小干扰RNA转染的对照组相比更高，穿膜细胞数也更多，提示乳腺癌细胞的迁移能力和侵袭能力上升(P<0.05)，见图1、图2。这种负向调节的作用进一步说明了TUSC3在乳腺癌中的抑制作用，但它的作用机制还有待进一步研究。

肿瘤细胞发生远处转移是一个涉及多个步骤的过程，包括上皮—间质转化(epithel-mesenchymal transition，EMT)、局部侵袭、进入血管、通过血管迁移、外渗和在其他组织定植等，而EMT是肿瘤细胞发生远处转移的先决条件[7]。研究显示，肿瘤细胞侵袭转移的主要因素之一是获得EMT样表型[3]。目前有研究发现，TUSC3在结直肠癌[6]、卵巢癌[8]中发挥的作用均与EMT过程相关。EMT(上皮-间质转化)是指上皮细胞通过逐渐丧失其细胞极性、细胞间紧密连接和黏附连接，使细胞增加侵袭力和迁移能力，并产生了大量细胞外基质成分来抑制细胞凋亡，逐渐变成了具有间质细胞形态和特性的细胞[9]。EMT主要的分子特征就是两个关键分子表达的变化，即E-Cadherin下降，Vimentin表达上升。本实验结果显示，与对照组相比，敲减TUSC3表达后，E-Cadherin表达下降，Vimentin上升(P<0.05)，见图3。符合EMT表型的分子特征。因此，我们认为敲减TUSC3表达后乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强可能与EMT相关。研究发现，有几种信号途径与EMT过程相关：(1)MAPK通路：ERK通路、JNK通路、p38MAPK通路[10]；(2)TGF-β信号通路[11]；(3)Wnt/beta-catenin通路[12]；(4)NF-κB信号通路[13-14]；(5)Notch信号通路[15]；EMT相关细胞信号可以激活多条分子信号通路，而这些通路上的分子又可以激活EMT相关的转录因子的表达，互相作用。