鍉针点按法对缺血性卒中后大鼠大脑皮层脑源性神经生长因子的影响

杨 康，胡冠宇，王宇峰，谢东伶，丛德毓*

（1.长春中医药大学针灸推拿学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院 针灸推拿科，长春 130021）

缺血性脑卒中（ischemic stroke,AIS）是由脑部缺血缺氧引发一系列缺血性级联反应所导致的一种具有高发病率且发病机制十分复杂的难治性疾病[1]，约占全部卒中的80%[2]。其在我国死亡率居高不下，仅次于恶性肿瘤[3]。不仅如此，缺血性脑卒中的高复发率及年轻化态势更是让研究者们面临着严峻挑战。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不仅能够促进脑损伤后神经功能和运动功能的恢复，而且参与营养和保护中枢神经系统的发育。卒中后脑缺血导致脑源性神经生长因子分泌减少，神经功能恢复受到抑制。现代医学证实，推拿点按手法可改善大脑及四肢的血液循环，促进脑源性神经生长因子的表达。本研究旨在观察鍉针点按干预方法对脑源性神经生长因子在缺血性卒中后大鼠脑组织中表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 武汉三鹰生物技术有限公司提供BDNF 抗体，货号：28205-1-ap，分子量28-30KD，种属：Rabbit，一抗稀释比：1:1 000，二抗稀释比：1:5 000，鍉针全长17 cm，针头直径4 mm，北京中研太和医疗器械有限公司提供。

1.2 实验动物 雄性SPF 级SD（Sprague-Dawley）大鼠24 只，体质量280～300 g，许可证号：SCXK（吉）·2018-007。自由饮水与进食，适应环境饲养1周后进行试验。

1.3 动物模型 采用线栓法建立大鼠局灶性永久性脑缺血模型[4]。大鼠麻醉后仰卧固定，颈部正中纵行切口后暴露左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），分离迷走神经，在近心端结扎CCA、ECA，将线栓在距离CCA 分叉处4 mm 切一小口轻插入ICA 约18 mm，将绕在ICA远端的细线扎紧，最后将CCA远端的细线扎紧并缝合。假手术组仅剥离皮下肌肉组织。手术后用Zea Longa 评分评价造模是否成功。

1.4 干预方法 大鼠根据李忠仁主编的《实验针灸学》[5]进行固定，假手术组和模型组仅抓取、固定，治疗组将压力传感器接头置于大鼠头部顶颞前斜线上，手持鍉针进行垂直点按，力度控制在5 N 左右，停留5 s，间隔3 s，每次10 min，每天1次，时间均连续2 周。

1.5 脑神经功能评价 根据Zea Longa 评分标准[6]：0 分为无神经损伤症状；1 分为无法完全伸展对侧前爪或后爪；行走时向手术对侧转圈为2 分；3 分为行走时向手术对侧倾倒；4 分为不能自发行走，意识丧失。分别在造模后及治疗结束后各评分1 次。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 HE 染色 神经功能评分测试后，各组随机抓取2只大鼠，10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉，灌注后整个大脑被迅速取出并储存于4%多聚甲醛中24～48 h；取中央前回2 mm 的左侧大脑皮层组织，固定、脱水、石蜡包埋，连续切4 μm 薄片，60 ℃烤片2h 备用。

1.6.2 TTC 染色 2 周后，取脑组织，冠状切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸缓冲液，计算脑梗死面积。脑梗死面积=（白色的梗死面积/片子的总面积）×100%。

1.6.3 Western Blot、Q-PCR 检测各组大鼠脑组织皮层BDNF、BDNFmRNA 表达变化 2 周后，断头处死各组剩余4 只大鼠，梗死侧皮质在冰盘上迅速取出，液氮速冻，-80 ℃保存，等待检测BDNFmRNA及蛋白表达。

1.7 统计学方法 统计软件采用SPSS 19.0进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，t检验比较组间差异，计数资料以n（%）表示。统计图用Graph Pad prism 6 软件绘制。

2 结果

2.1 组间神经功能评分比较 见表1。

表1 组间神经功能评分比较（，n=8）

表1 组间神经功能评分比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05

2.2 组间脑梗死面积比较 见表2，图1。

表2 组间脑梗死面积比较（，n=8）

表2 组间脑梗死面积比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05

2.3 组间脑组织病理学形态比较 见图2。与模型组相比较，脑组织结构在假手术组与治疗组相对完整，细胞形态较正常，增殖明显，而脑组织在模型组结构疏松，脑膜不完整，神经元细胞形状不规则，胞核固缩深染，可见大量不规则空洞。

图2 各组大鼠脑组织病理学形态比较

2.4 组间BDNF 蛋白水平比较 见表3，图3。

表3 组间BDNF 蛋白水平比较（，n=8）

表3 组间BDNF 蛋白水平比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05

图3 各组大鼠BDNF 蛋白水平比较

2.5 组间BDNF mRNA 水平比较 见表4。

表4 组间BDNF mRNA 水平比较（，n=8）

表4 组间BDNF mRNA 水平比较（，n=8）

注：与假手术组比较，# P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05

3 讨论

卒中发病突然，我国脑卒中发病率据2019 年全球疾病负担研究数据显示为39.9%[7]，缺血性卒中发生发展过程中，脑组织局部血流供应受阻，缺血、缺氧导致神经元细胞凋亡或发生不可逆坏死，这是造成中风患者神经功能障碍的主要病理基础。大量研究表明，海马和皮层中高表达脑源性神经生长因子[8]，脑源性神经生长因子及其下游通路可促进受损神经的神经元生长、发育、分化、轴突树突生长、调节突触可塑性以及再生修复等[9]。此外，缺血性卒中后脑组织一氧化氮合酶能被脑源性神经营养因子抑制，从而减轻神经元遭受自由基的损伤程度[10]。

在缺血缺氧脑病病程早期，脑源性神经生长因子可通过影响转录因子结合DNA 的活性或激活特定的信号转导通路来保护神经元免受氧化应激损伤，随着缺血缺氧脑病的进展，会引起脑神经发育障碍，进而对脑源性神经生长因子的表达和分泌造成不利影响，导致严重的神经元损伤[11-12]。

《内经》曰：“其有三虚而偏于邪风，则为击仆偏枯矣”，首次提出脑梗死这一病名，在《医学纲目》中，首次出现卒中这一病名的描述症状以突然昏倒，不省人事，口舌涡斜，半身不遂，言语蹇涩为主，与脑梗死症状相似。虚、火、风、痰、气、血在现代医学中认为是中风的主要病因病机，本虚标实贯穿疾病始终。头部腧穴治疗脑梗死，《灵枢·五乱》曰：“气乱头则为逆，苏醒免灾危”，是对头部相关腧穴治疗中风的早期描述，《灵枢·热病》曰：“偏枯，身偏不用而痛……益其不足，损其有余”，界定中风病的实则泻之，虚则补之的治疗原则。

《灵枢·九针十二原》：“鍉针，长三寸半。”[13]《内经》记载其起源于夏、商、周时代，到了春秋战国时期基本发展成型[14]。《针灸集成·制九针法》曰：“脉气虚少宜鍉针。”是对鍉针的用途作进一步注释。《灵枢·官针第七》载：“三者人也，人之所以成生者血脉也。”[15]古人将鍉针比作人部，人体的生命活动皆有赖于血脉的濡养，鍉针尖圆润，不伤血脉，用以疏通脉痹正宜。

“头为诸阳之会，元神之府”，解剖上，中医认为“脑为髓之海”，头部点按区域正好位于脑缺血病灶附近，对于脑梗死的治疗更为直接；生理上，“百脉之气皆归于头”，全身经脉血气都汇聚于头脑空窍，针刺或点按头部腧穴功能区可通过神经、血管、内分泌等机制间接作用到梗死的脑组织，从而发挥快速有效的治疗作用，如王顺等[16]认为头针起效的主要机制是头针可以诱发颅内相应皮质区产生动态电位（MEP）。吴绪平等[17]研究表明，头穴透刺可减轻脑缺血患者脑水肿程度，主要是通过降低脑内β-内啡肽含量，对病灶区脑组织起到治疗作用。于氏[18]认为人体一身之经络皆汇聚于头部，刺激特定的头皮区域既能调理经络气血，又能直接作用于病损皮层，改善微循环，提高供血供氧，这种刺激可改善缺血性半暗带区域脑组织神经元缺血缺氧的状态[19]。

《头皮针穴名国际标准化方案》通过后，很多学者致力于头针的机理机制研究[20]。顶颞前斜线在生理解剖结构上，又与大脑中央前回相对应，而此区功能又与肢体痉挛的治疗相对应，故点按此区域，刺激头皮可以直接作用于其下的大脑皮层，能够激活Trk B信号传导，脑源性神经生长因子联合Trk B 等保护神经元，减轻神经元损伤。

基于国医大师任继学和石学敏院士的学术思想，从“脑损络伤”的病机出发，故以鍉针点按头部顶颞前斜线功能区为主，通脉活血、补益脏腑、平衡阴阳，进而起到调畅全身阴阳经脉气血的作用，使得筋脉自柔的同时又能补泻经气，促进中风后恢复。

本研究结果表明：鍉针点按治疗在脑缺血模型大鼠的神经功能评分、脑梗死面积、脑源性神经生长因子蛋白和mRNA 含量方面有显著作用（P＜0.05）。