光合细菌对铬污染土壤中小白菜生长和铬积累的影响*

2021-06-24任晓斌卫燕红杨官娥王海宾薛海龙白红娟

中北大学学报(自然科学版) 2021年3期

任晓斌，卫燕红，杨官娥，王海宾，薛海龙，白红娟

(1. 中北大学环境与安全工程学院，山西太原 030051； 2. 山西医科大学药学院，山西太原 030001；3. 华晋瑞海科技有限公司，山西太原 030002)

0 引言

由于采矿、工业三废排放、城市生活垃圾堆放等众多原因，农业土壤的铬污染日益严重[1]. 铬在土壤中主要以三价Cr(III)和六价Cr(VI)两种价态存在，微量的Cr(III)是生命体所必需的元素，且它在环境中不易发生迁移，生物利用度低； Cr(VI)以铬的阴离子存在，具有较高的积累性和生物迁移性，容易被植物吸收富集，过量的铬积累会使植物铬含量超标，影响植物生长，甚至通过食物链危害人体健康；同时， Cr(VI)的毒性是Cr(III) 的100倍，且可能对生命体产生致癌、致异和致畸等作用[2]. 因此，如何治理六价铬污染的蔬菜田和减少铬向蔬菜中迁移再分配，保障蔬菜安全生产，已经成为人们研究的热点之一.

目前，针对六价铬污染土壤的修复思路主要是通过改变铬在土壤中的存在形式，将Cr(VI)还原成Cr(III)，降低铬在环境中的迁移能力和生物可利用性. 微生物修复是一种环境友好的治理技术，具有较好的发展前景. 国内外学者报道脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)[3]、芽孢杆菌(Bacillussp.)[4]和草酸青霉(Penicilliumoxalicum)SL2[5]等菌株通过将Cr(VI)还原成Cr(III)来修复污染的土壤. 光合细菌是具有原始光能合成体系的原核生物，能在厌氧光照条件下进行不放氧光合作用，特别是光合细菌中的紫色非硫细菌，具有随着生存环境而灵活改变代谢类型的特性，同时也是益生菌[6]. 范文宏等[7-8]利用光合细菌球形红细菌Rhodobactersphaeroides修复镉或铅污染的土壤，经该菌株修复后的土壤种植小麦， Cd和Pb在小麦根和叶中的积累都有所减少. 本课题组[9-11]研究结果表明，光合细菌球形红细菌RhodobactersphaeroidesH菌株能明显改变土壤中Cd和Pb的赋存形态，同时改善污染土壤中微生物群落DNA序列的多样性，减少蔬菜中Pb和Cd的累积，提高农作物品质. 前期研究工作表明，光合细菌H菌株能有效还原水中Cr(VI)，其机制包括生物还原和积累[12]. 基于此，本文利用H菌株对铬污染土壤进行生物修复，并以小白菜为供试材料，通过盆栽试验研究光合细菌对铬污染土壤中小白菜生长及铬积累的影响，以期为光合细菌修复铬污染土壤及其安全利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：光合细菌H菌株系紫色非硫菌群红细菌属的球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)，由山西大学光合细菌研究室惠赠[13].

培养基：基础培养基采用光合细菌液体培养基[13].

试剂：浓硝酸、高氯酸均为优级纯，其余所用试剂均为分析纯.

仪器：紫外-可见分光光度计(8000S型)，雷磁pH计(PHS-3C型)，光照培养箱(GXZ-260A型)，超净工作台(SW-CJ-1F型)，水浴恒温振荡器(WE-2型)，高速离心机(HC-3018型)，人工气候箱(MGC-400H型)，不锈钢电热板(DB-3型)，电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP 7000型).

供试小白菜品种为四季小白菜，在2019年6月 10日播种， 2019年7月20日收获.

1.2 土壤样品的采集、处理

土样取自山西省太原市尖草坪区上兰村，深0 cm～20 cm，基本性质见表1，取回实验室后去除杂质，过2 mm尼龙筛，利用K2Cr2O7配制成4种不同浓度铬(25 mg·kg-1, 50 mg·kg-1, 75 mg·kg-1和100 mg·kg-1)的土壤，平衡30 d，灭菌，备用.

表1 供试土壤基本性质

1.3 实验方法

光合细菌对铬污染土壤的生物修复：光合细菌和铬浓度分别用R，C表示，实验设5个铬污染浓度，分别为C0(0 mg·kg-1)，C1(25 mg·kg-1)，C2(50 mg·kg-1)，C3(75 mg·kg-1)，C4(100 mg·kg-1)，在所设的每个铬浓度下，再设4个菌剂接种量，分别为R0(不加光合细菌)，R1(107个/克土)，R2(108个/克土)，R3(109个/克土)，以R0作为对照，组成20个实验组. 将培养好的带有菌体的液体培养基按照实验设计依次加入到土壤中，混合均匀，用保鲜膜对每个花盆封口，保证光合细菌所需的厌氧环境，每盆中的土壤质量为1.5 kg，将各处理组置于30 ℃的人工气候箱中培养，并保持田间持水量的60%，培养一个月.

小白菜盆栽实验：选取饱满、大小一致的小白菜种子浸种、催芽后均匀种植于上述花盆中，每盆定植5棵白菜，每组3个平行，并保持田间持水量的60%，随机置于室内自然光下生长， 40天后收获小白菜，先用自来水将植株冲洗干净，最后用去离子水润洗，吸干表面水分，分成地上部分和地下部分，保存，待测.

1.4 测定项目及方法

小白菜的株高和根长：收获小白菜后，用自来水清洗植株和根部，测量3次株高和根长，并取平均值.

植物中叶绿素含量的测定采用丙酮浸提法[14].

植物中可溶性糖含量的测定采用苯酚硫酸法[15].

植株中铬含量的测定：收获植株的根、茎、叶于105 ℃下杀青0.5 h， 75 ℃烘干至恒重，称取适量的地上部分和根系干质量，用配比为HNO3∶HClO4=4∶1的消解液进行消解，消解液中铬含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定. 采用转移系数(TF)表示铬在小白菜各部位中的迁移特性，转移系数计算公式为

TF=植株地上部分的铬含量(mg·kg-1)/

植株根系的铬含量(mg·kg-1).

土壤中铬的五种形态提取方法及测定：称取部分烘干土样，采用Tessier连续提取法[16]，分别提取可交换态、碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机质结合态、残渣态，土壤样品用HNO3-HCl-HClO4电热板消解，采用ICP-OES进行铬含量的测定.

1.5 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2010和Origin8.5软件分析与作图，并运用SPSS22.0软件对测定数据进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜株高和根长的影响

图1 和图2 分别是不同处理组对小白菜株高和根长的影响.

图1 不同处理组对小白菜株高的影响

图2 不同处理组对小白菜根长的影响

由图1 和图2 可以看出，在加入光合细菌之前，小白菜的株高和根长随着铬浓度的增加而减小，说明铬浓度对株高和根长的影响是显著的(P<0.05). 在同一铬浓度条件下，与对照组相比，随着光合细菌量的升高，小白菜的株高和根长均有所增加，且在加菌量为108个/克土时，效果较好，此时与加菌前相比，C0～C4处理组的株高分别增加了9.09%， 4.71%， 8.97%， 7.35%和6.45%，根长分别增加了6.25%， 4.6%， 5.13%， 4.05%和5.8%，可见光合细菌量对株高和根长的影响也是显著的(P<0.05).

2.2 光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜叶绿素含量的影响

图3 是光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜叶绿素含量的影响. 图中，同一柱形，字母不同表示差异显著(P<0.05). 后续各图均同.

图3 光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜叶绿素含量的影响

由图3 可知，无论加菌与否，植株中的叶绿素含量随着铬浓度的增加而显著减少(P<0.05)，尤其在铬浓度大于50 mg·kg-1时，下降趋势更加明显. 加入光合细菌处理后，与对照组相比，各金属铬浓度下植株的叶绿素含量均显著增加(P<0.05)，且在施加量为108个/克土时，叶绿素含量最多，分别升高了20.89%， 13.78%， 12.30%， 15.29%和14.19%.

2.3 光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜可溶性糖含量的影响

光合细菌量也会对小白菜的可溶性糖含量产生一定的影响(图4)，与对照组相比，相同铬浓度条件下，随着光合细菌量的增加，植株的可溶性糖含量显著升高(P<0.05)，并且在加菌量为108个/克土时可溶性糖含量最多，比对照组分别升高了15.93%， 13.45%， 11.75%， 10.07%和13.69%，可见光合细菌有利于植物的可溶性糖含量升高，对植物的生长有积极作用.

图4 光合细菌对不同浓度铬污染土壤中小白菜可溶性糖含量的影响

2.4 光合细菌对植株铬含量的影响

表2 是光合细菌对小白菜各组织Cr含量的影响.

表2 光合细菌对小白菜各组织铬含量的影响

从表2 中可以看出，各实验组和对照组中根的Cr浓度均远高于茎、叶，说明Cr主要在根中积累. 而且，在相同铬浓度条件下，随着光合细菌量的增加，植株的地上部分和根系的铬含量都在减少，说明光合细菌量与植株的地上部分和根系的铬含量具有显著相关性(P<0.05)，相应的转移系数也在下降，并且最适加菌量为108个/克土，此时与对照组相比，C1(25 mg·kg-1)处理组中地上部分和根系分别降低了 33.32% 和 18.46%，C2(50 mg·kg-1)处理组中地上部分和根系分别降低了19.83%和8.44%，C3(75 mg·kg-1)处理中组地上部分和根系分别降低了15.18%和8.28%，C4(100 mg·kg-1)处理组地上部分和根系分别降低了15.05%和5.61%. 由此可见，光合细菌对铬的植物利用度有明显的降低作用.

2.5 光合细菌对土壤中铬的形态的影响

为了了解铬在生物修复前后的形态变化，测定了试验组(C1R2，C2R2，C3R2，C4R2)和对照组(C1R0，C2R0，C3R0，C4R0)中铬的五种形态含量，由图5 可知，加入光合细菌前，土壤中铬的形态主要以残渣态和可交换态为主，经光合细菌修复后，残渣态含量、有机结合态和铁锰氧化态含量增加，碳酸盐结合态和可交换态含量减少.

图5 光合细菌对土壤中铬的形态的影响(左：对照; 右：加菌)

与对照组相比，C1～C4处理组中铬的残渣态分别增加了37.64%， 25.69%， 32.52%和22.85%；有机结合态分别增加了 21.92%， 30.51%， 39.90%和35.34%；铁锰氧化态分别增加了30.51%， 30.68%， 23.22%和25.29%；碳酸盐结合态分别降低了44.42%， 29.00%， 28.32% 和20.49%；可交换态分别降低了 48.14%， 24.80%， 16.01%和40.22%，使得残渣态和有机结合态成为主要相.

3 讨论

本研究试验结果表明, 铬对小白菜的生长有一定的抑制作用. 也有研究发现，重金属胁迫会造成植物抗氧化酶系统紊乱、打破植物体内金属离子平衡系统，抑制其光合作用和生长[17-18]，为了降低重金属污染对植物生长的不利影响，在土壤中接种微生物或者重金属钝化菌剂，提高植物对重金属的耐受性，成为当前重金属生物修复的研究热点. 熊智慧等[19]通过接种Alcaligenessp. qz-1改善了铬胁迫下玉米生长特性, 降低了铬对玉米的毒害. Debiec等[20]通过砷氧化细菌对砷污染土壤进行生物强化修复，结果表明，菌株在土壤中的存在促进了植株的生长.

重金属还会通过抑制植物体内某些酶的合成，降低其叶绿素和可溶性糖含量. 简敏菲等[21]研究了重金属镉、铅胁迫下湿地植物丁香蓼的生理生化特征，结果表明：丁香蓼叶片的叶绿素a、 b的含量均随着重金属污染物胁迫浓度的增加而呈下降趋势. 在土壤中接种微生物，则有助于缓解重金属胁迫对植物叶绿素和可溶性糖含量的不利影响. 刘玉玲等[22]通过实验发现， Cd胁迫下添加Delftia sp. B9菌液能显著增加水稻幼苗的叶绿素和可溶性糖含量. 本研究中，在土壤中接种光合细菌不仅可以有效增加铬胁迫下小白菜的株高和根长，还可以提高小白菜叶片叶绿素和可溶性糖含量，表现出良好的促生能力. 这主要是因为光合细菌对Cr(VI)具有一定的生物还原作用[12]，土壤中的部分Cr (VI)被有效还原为Cr(III)，改变了土壤中铬的生物有效性，减弱了根系对铬的吸收；另一方面， Cr(III)的毒性要远远低于Cr(VI)，能够为土壤中微生物提供良好的生存环境，促进有益微生物繁殖，加快土壤中有机质分解[2]，从而增强了合成叶绿素有关酶的活性, 提高了叶绿素和可溶性糖含量，促进了植株的生长. 同时，光合细菌接种量为108个/克土时，小白菜的叶绿素和可溶性糖含量最多，生长得最好，接种量大于108个/克土时，效果会有所下降，这主要是因为在一定的空间、有限的资源内，存在一个最适接种量，接种量过多会加剧微生物之间的竞争，导致部分微生物死亡，同时也可能是光合细菌靠植物供给部分营养，若接种量过多将大量消耗植物营养，影响植株生长，从而出现下降的趋势[23].

研究还发现，微生物在促进植物生长的同时, 也可以影响植物对重金属的吸收利用，这在相关文献中也有报道，如Gordeeva等通过研究发现，在砷污染土壤中加入固氮菌和芽孢杆菌后，显著影响了根际土壤中砷的流动性，有助于砷在土壤中的固定，阻止其进入植物细胞[24]. 重金属的毒性和生物利用度主要取决于其形态，而不是总浓度[25]. 据报道，可交换相和与碳酸盐结合相很容易被植物根系吸收，残余相是很难被利用的[26-27]. 因此，金属形态的变化，特别是可交换态的变化，会直接影响重金属的生物有效性，进而影响修复效率. 范文宏教授课题组[7-8]利用光合细菌对Pb、 Cd的生物修复结果表明，光合细菌可以显著减少Pb、 Cd的可交换态，更多地将可利用组分转化为不易获得的惰性组分，铅、镉污染土壤的修复机制主要是硫化铅、硫酸铅和硫化镉等惰性化合物的沉淀形成降低了重金属的生物有效性. 另外，金属价态的变化也会影响重金属的生物有效性， Goulhen等[3]在高浓度Cr(VI)环境中生长的脱硫弧菌细胞表面发现了还原形式的Cr(III)沉淀，说明脱硫弧菌对Cr(VI)具有一定的还原作用；叶斌晖等[5]研究发现，在草酸青霉SL2对铬污染土壤的生物淋洗过程中，泥浆中Cr(VI)浓度迅速降低， TCr的含量不断升高，而Cr元素在环境中一般以三价和六价为稳定价态，可知其中的Cr(VI)应是被还原为Cr(III). 体系中Cr(VI)的充分还原可显著降低其生物毒性及迁移性[28]，在本研究中，通过光合细菌对铬污染土壤进行生物修复，结果发现，土壤中铬的五种形态含量发生明显变化，碳酸盐结合态和可交换态含量减少，残渣态含量、有机结合态和铁锰氧化态含量增加. 由于可交换相较其他形态更容易释放，可以解释在此过程中铬的可交换性相明显减少. 碳酸盐结合态在土壤中属于易溶解相[29]，而光合细菌可以提高土壤中某些酶的活性，进而促进碳酸盐结合态的溶解. 此外，光合细菌能有效还原铬(VI)[12]，而还原后的Cr(III)可能以Cr(OH)3或CrPO4的形式固定在细胞表面[30]，使得残渣态含量增加；铁锰氧化态和有机结合态容易与还原后的部分Cr(III) 发生络合作用[29]，使得两种组分的含量增加，最终改变了土壤中铬的形态含量分布，由此降低了重金属的生物利用度和土壤的毒性，这也是小白菜对土壤中铬的吸收和积累减少的原因.