D NA甲基化对邻苯二甲酸单乙基己酯致小鼠睾丸间质细胞损伤的作用

翁晓梦，李 玲，德小明，李丽萍，宋贝贝，黄金瑞，郭晓英，马慧颖

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业卫生与环境卫生学系，宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，生育力保持教育部重点实验室，银川 750004）

邻苯二甲酸酯类物质（phthalic acid esters，PAEs）是一种环境内分泌干扰物，其中邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）作为广泛使用的增塑剂，常用做聚氯乙烯（PVC）制品、塑料袋、工业涂料、化妆品、食品包装、输血袋等的原料，是迄今为止我国产耗量最大、应用最为广泛的增塑剂类型[1]，被列为人类可能致癌物（IARC分类为Group2B[2]。DEHP进入体内后通过哺乳动物肠道水解酶的作用代谢为邻苯二甲酸单乙基己基酯（MEHP），研究表明MEHP毒性高于DEHP，在PAEs致生殖发育毒性中发挥主要作用[3]。体内外研究结果证实[4]，在胚胎期暴露环境内分泌干扰物引起的表观遗传修饰，可以诱导基因表达的改变，并且这种改变可能在整个生命周期中持续存在，表观遗传学最主要的表达方式之一是DNA甲基化，在MEHP致睾丸间质细胞（TM-3）雄性生殖毒性的研究中，对DNA甲基化水平的研究尚不够深入，因此本研究拟从表观遗传学的角度来深入探讨MEHP的雄性生殖毒性机制，进而为后续的靶向研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源、主要仪器和试剂

睾丸间质细胞株（TM-3细胞，美国ATCC细胞研究中心）。HF90 CO2培养箱（中国上海力申科学仪器有限公司），SW-CJ-1CU超净工作台（中国苏州安泰空气技术有限公司），CKX41倒置相差显微镜（日本Olympus公司），Neofuge15R高速冷冻离心机（中国上海力申科学仪器有限公司），I510全波长酶标仪（芬兰赛默飞世尔公司），LDZM-40KCS-II立式压力蒸汽灭菌器（中国上海申安医疗器械厂），BioRad荧光实时定量PCR仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

MEHP标准品（纯度为97%，美国Sigma公司），DMEM培养基、青链霉素混合液、胰酶、胎牛血清、DMSO等（美国Gibco公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒，Hoechst荧光染色试剂盒（中国江苏凯基生物有限公司），5-甲基胞嘧啶（5-mc）免疫荧光抗体（美国CST公司），荧光二抗（中国北京中杉金桥），柱形核酸纯化产品、Prime-ScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ实时荧光定量试剂盒（大连宝生物工程有限公司）、目的基因及内参基因引物（中国上海生工生物公司），其他试剂均为国产分析纯。

MEHP染毒液配制：用适量的无菌DMSO标准品稀释质量为0.5 g MEHP标准品，配制成浓度为1.80 mol·L-1母液，然后用无菌培养基梯度稀释成0（对照组）、50、100、200、400、800μmol·L-1的染毒液备用。

1.2 TM-3细胞培养

复苏TM-3细胞，离心弃掉冻存液，加入新配制浓度为10%的完全培养基，培养48 h后换液；待细胞增殖至对数生长期，吸弃旧培养基，加入2 mL PBS清洗，清洗结束后加入1 mL胰酶消化30 s，然后加入4 mL完全培养基终止消化，制成单细胞混悬液，平均分置两个新培养瓶；新培养瓶中加入完全培养液定容至4 mL，混匀，于37℃、5%CO2、100%相对湿度培养箱中培养24～48 h，待细胞进入对数生长期，进行后续实验。

1.3 CCK-8法检测细胞活力

取处于对数生长期的TM-3细胞，胰酶消化后加入完全培养基配成细胞混悬液，然后吸取100μL加入96孔板（约7000个细胞/孔），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养数小时。待细胞贴壁后弃去培养基并加入浓度为0、50、100、200、400、800μmol·L-15个梯度的MEHP染毒液，再将96孔板放置于37℃、5%CO2、100%湿度的细胞培养箱中孵育24 h。向各孔中加入10μL的CCK-8检测液，37℃孵育1～2 h后，在酶标仪450 nm波长下检测各孔光密度（OD）值并计算细胞活力（%）=［（染毒组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）］×100%。

1.4 光学显微镜观察细胞形态

取处于对数生长期的TM-3细胞，胰酶消化后加入完全培养基配成细胞混悬液，吸取1 mL细胞混悬液并加入9 mL完全培养基至15 mL的离心管中，分别吸取1 mL细胞悬液加入4个培养瓶中，并定容至4 mL，待细胞铺满瓶底60%～70%，加入上述5个梯度的MEHP染毒液，24 h后于光学显微镜下（×400）进行观察。

1.5 5-mc免疫荧光法检测细胞总甲基化水平

实验原理：通过检测5-mc的含量来推断细胞整体甲基化水平，荧光信号强度可以直接反映细胞总甲基化水平的高低。

方法：用清洁盖玻片（14 mm×14 mm）放入24孔板细胞培养孔中，然后接种少量细胞进行培养，待细胞爬片后（6～8 h），对细胞进行染毒并培养24 h，染毒结束后用PBS轻柔漂洗3次，每次5 min吸净PBS后加入1 mL 4%多聚甲醛于室温固定（20 min），然后去掉多余甲醛再用PBS轻柔漂洗3次；继续加入0.3%Triton-100 1 mL，进行透化处理（40 min），清洗同上，继续加入5%BSA溶液，室温封闭1 h，吸尽BSA溶液，在每个爬片加入100μL一抗，4℃过夜，清洗同上；第2天，每个爬片加入100μL二抗，于室温避光孵育1 h，清洗同上，最后在载玻片上加一滴抗淬灭剂，用镊子取出爬片轻轻倒扣在载玻片上，在荧光显微镜下进行观察。在相同荧光显微镜观察条件下随机选取3个视野拍照，并用Image J软件计算平均单个视野下的荧光强度。

1.6 RT-PCR检测DNA甲基转移酶（DNMTs）mRNA表达水平

用柱形核酸纯化试剂盒提取TM-3细胞总RNA，然后根据反转录试剂盒说明书进行cDNA合成，以此为模板进行PCR扩增（引物序列见表1），扩增条件：95℃30 s，95℃5 s，55℃30 s，40个循环。并以95℃10 s，65℃5 s，95℃5 s，测定熔解曲线，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因，DNMTs（包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）相关基因mRNA相对含量用2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 DNMTs相关基因引物序列

1.7 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡变化

TM-3细胞爬片同免疫荧光的操作过程，染毒结束后，用预冷的Buffer A洗涤细胞2次，加入1 mL的4%多聚甲醛溶液，固定细胞10 min，继续用Buffer A洗2遍，最后滴加50～100μL Hoechst33258工作液，室温染色10 min，水冲净晾干，在相同荧光显微镜观察条件下随机选取3个视野拍照，并用Image J软件计算平均单个视野下的荧光强度，荧光强弱可间接反映MEHP诱导细胞凋亡变化的程度。

1.8 统计学方法

数据采用SPSS 25.0统计软件进行分析，每项实验均重复3次以上，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD法。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 MEHP对TM-3细胞活力的影响

预实验设置毒物浓度梯度为0、50、100、200、400、800μmol·L-1，染毒24 h后测定OD值；与对照组相比，细胞活力下降（P均＜0.01），见表2。运用Graphpad prism 6.0计算MEHP的IC50为354.4μmol·L-1，因此选取MEHP终浓度200、400、800μmol·L-1作为后续实验的染毒浓度。

表2 不同浓度MEHP作用24 h对TM-3细胞活力的影响（n=3，±s）

表2 不同浓度MEHP作用24 h对TM-3细胞活力的影响（n=3，±s）

与对照组相比**P＜0.01。

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2.2 不同浓度MEHP作用24 h后TM-3细胞形态学变化

正常细胞呈梭形、多边形等不规则形状生长，随着染毒剂量的增加，贴壁细胞数量逐渐减少，细胞核呈现空泡化，条索状细胞增多，且漂浮的死亡细胞数逐渐增加，见图1。

图1 不同浓度MEHP作用24 h后TM-3细胞形态学变化（×100）

2.3 MEHP对TM-3细胞总甲基化水平的影响

与对照组比较，200μmol·L-1组荧光信号最强，400μmol·L-1组次之，800μmol·L-1组最弱，不同浓度MEHP暴露均可引起TM-3细胞总甲基化水平降低（P均＜0.01），见图2、表3。

图2不同浓度MEHP作用24 h对TM-3细胞5-mc表达水平的影响（×200）

表3 不同浓度MEHP作用24 h后TM-3细胞总甲基化水平的变化（n=3，±s）

表3 不同浓度MEHP作用24 h后TM-3细胞总甲基化水平的变化（n=3，±s）

与对照组相比**P＜0.01。

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2.4 MEHP对TM-3细胞DNMTs mRNA表达水平的影响

RT-PCR结果显示：与对照组相比，200μmol·L-1组DNMT1mRNA（1.15±0.08）、DNMT3BmRNA（2.28±0.15）相对表达水平均高于对照组（P＜0.05或＜0.01）；DNMT3AmRNA（1.03±0.12）表达水平两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；400μmol·L-1组DNMT1mRNA（0.83±0.05）低于对照组（P＜0.01），DNMT3AmRNA（1.91±0.44）和DNMT3BmRNA（2.50±0.09）表达水平高于对照组（P＜0.05或＜0.01）；800μmol·L-1组DNMT1mRNA（0.50±0.08）低于对照组，DNMT3AmRNA（2.40±0.51）高于对照组（P＜0.01），DNMT3BmRNA（1.02±0.01）表达水平和对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3不同浓度MEHP对TM-3细胞DNMTs mRNA相对表达水平的影响（n=3，±s）

2.5 MEHP对TM-3细胞凋亡水平的影响

Hoechst33258荧光染色显示，不同浓度MEHP暴露，均可诱导TM-3细胞凋亡（P均＜0.01），400、800μmol·L-1两组可以观察到明显的染色质固缩，核浓染现象，凋亡细胞数目逐渐增多，见图4、表4。

图4 不同浓度MEHP作用24 h诱导TM-3细胞凋亡形态变化（×400）

表4 不同浓度MEHP作用24 h诱导TM-3细胞凋亡情况（n=3，±s）

表4 不同浓度MEHP作用24 h诱导TM-3细胞凋亡情况（n=3，±s）

与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

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3 讨论

关于PAEs类物质毒作用机制的研究进展，主要有三个方向：一是改变下丘脑-垂体-性腺轴的表达；二是诱导氧化应激损伤途径；三是从表观遗传学的角度[5]。在环境污染物对人类健康造成影响的过程中，表观遗传学发挥着重要的作用，其中DNA甲基化是表观遗传学最主要的表达方式。DNA甲基化是指在DNMTs的催化作用下，将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的甲基转移到胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的第5位碳原子上，形成5-mc化学修饰的过程[6]。在DNMTs中，DNMT1作为哺乳动物最主要的维持甲基化酶，表达于复制状态的增殖细胞，能够优先催化复制后半甲基化的DNA双链，使低甲基化的子链完全甲基化。DNMT3A和DNMT3B是重新甲基化酶，作用于未甲基化的DNA双链。有研究报道[7]，在人体尿液中检测到DNA甲基化和羟甲基化过程的产物：5-甲基-2'-脱氧胞苷（5 mdC）和5-羟甲基-2'-脱氧胞苷（5 hmdC），且尿液中5 mdC和5 hmdC的浓度与接触PAEs类物质的水平呈正相关关系。另一项研究表明：由DNA甲基化介导的精子活力，与低水平环境邻苯二甲酸酯暴露呈正相关关系[8]。

本实验结果显示，与对照组相比，随着MEHP染毒剂量的增加，细胞活力逐渐下降；光学显微镜观察显示，正常TM-3细胞呈梭形、多边形等不规则形状生长，随着染毒剂量的增加，贴壁细胞数量逐渐减少，细胞核呈现空泡化，条索状细胞增多，且漂浮的死亡细胞数逐渐增加；Hoechst33258荧光染色结果显示：随着染毒剂量增加，MEHP对DNA损伤程度加深，高剂量组的荧光信号最强，且能观察到明显的染色质浓染、核固缩，增加了细胞的凋亡水平。本课题组前期研究[9]结果显示：MEHP染毒24 h后，细胞存活率呈现下降趋势，MEHP染毒能够诱导GRP78-ATF4-CHOP凋亡通路，导致细胞凋亡，能够与本研究结果相互验证[10]。5-mc免疫荧光结果显示，MEHP导致TM-3细胞DNA甲基化整体水平降低，与对照组相比，200μmol·L-1染毒组荧光信号最强，400μmol·L-1染毒组次之，800μmol·L-1染毒组绿色荧光信号最弱；陈姣等[11]研究发现，MEHP可通过降低全基因组5-mc含量，从而促进前列腺癌的恶化、转移。有研究报道[12]，全基因组DNA的低甲基化可引起遗传的不稳定性，诱发并促进肿瘤的恶化，是参与肿瘤进展的重要因素。另有研究表明，全基因组DNA低甲基化是细胞恶化的基本特征之一[13]，与本研究与上述结果相近。与对照组相比，各组DNMT1和DNMT3BmRNA相对表达水平呈先升高后降低的趋势，在200μmol·L-1组可能存在低剂量刺激作用，导致细胞整体甲基化水平升高，随着染毒剂量增加，细胞整体甲基化水平逐渐降低，总体来说MEHP染毒导致TM-3细胞整体甲基化水平的降低；Li等[14]研究发现，邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）能够通过降低DNMT3B的表达水平诱导异常的PTEN去甲基化，进而导致生殖毒性；郑立娟等[15]的研究发现，非甾体类激素己烯雌酚能够导致小鼠精母细胞整体甲基化水平的降低，DNMTs蛋白和mRAN的相对表达水平也发生异常改变。上述发现与本研究结果相类似。

本次实验研究的不足之处：首先在检测细胞整体甲基化水平方面，仅选取了5-mc免疫荧光技术进行定性检测，并未进行一些定量研究；其次在DNMTs表达水平方面，并未对其蛋白翻译水平进行检测，也未加入相关的甲基化抑制剂进行验证。因此在后续的实验中，将会更加完善MEHP对DNA甲基化水平影响的实验方法，进一步深入探讨表观遗传学在MEHP致雄性生殖毒性中的作用。