N-(4-(2-乙酰氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺的合成、晶体结构及抗肿瘤活性研究

2021-06-24康佳铭李伟铭张志华

辽宁工业大学学报(自然科学版) 2021年3期

周芳，康佳铭，李伟铭，张志华

（辽宁工业大学化学与环境工程学院，辽宁锦州 121001）

索拉非尼（Sorafenib）（图1）于2005 年和2007年分别被美国FDA 批准用于治疗晚期肾癌和中期肝癌药物，在非小细胞肺癌、乳腺癌和甲状腺癌等领域亦有一定应用前景。Sorafeinib 是一种酪氨酸激酶（VEGFR 和PDGFR）和RAF/MEK/ERK 级联抑制剂[1-4]，同时作用于Raf-1 和BRAF[5]。此外，Sorafeinib 还对其他多种酪氨酸氨酸激酶如p38 和FGFR-1 亦具有较强的抑制作用。但Sorafeinib 仍有一些缺点，如对对B-Raf 激酶的活性较差，这也是Sorafeinib 对黑色素瘤抑制活性较差的原因之一[5]。研究发现，修饰Sorafeinib 末端酰胺及其相连接的吡啶环可提高药效及选择性，对黑色素瘤细胞的抑制活性也有一定的改善。将Sorafeinib 的末端酰胺片段替换为咪唑啉酮与吡啶环稠合片段，合成了系列脲、酰胺等衍生物，其中个别化合物抑制B-Raf激酶和对黑色素瘤生长的抑制活性均比Sorafeinib有所改良。此外，这些化合物的药动学性质也得到改进[6]。2016 年Michael Cerezo 等[7]报道了一种化合物HA15（图1），是特异靶向BiP/GRP78/HSPA5的小分子抑制剂。本实验运用拼合原理，把活性分子HA15 和Sorafeinib 结构中的优势结构片段进行融合，以期获得保留2 个模板分子的某些性质，设计结构新颖的的N-(4-(2-乙酰氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺，并筛选其抗肿瘤活性。

图1 目标化合物的设计思路

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

WRS-1B 数字显示显微熔点测定仪，Bruker IFS55-IR 或FTIR920 型红外光谱仪测定，Agilent Technologies LC/MS 1200 series-6130 Quadrupole 型液质联用仪，Bruker 400/54Premium Shielded NMR Magnet System，Bruker AXS Smart APEX II CCD 型X 射线衍射仪。所用试剂均为分析纯，未经纯化。

1.2 目标化合物的合成

目标化合物的合成如图2 所示。

图2 目标化合物（3）的合成路线

1.2.1N-(4-(4-硝基苯基)噻唑-2-基)乙酰胺 (1)的合成

将α-溴代对硝基苯乙酮（2.15 g，0.010 mol）、硫脲（0.84 g，0.011 mol）和无水乙醇（20 mL）混合后回流反应3 h。然后减压蒸馏除去溶剂，残余固体加入15 mL 乙酸酐，混合物在130 ℃微波加热搅拌反应0.5 h。降温后向混合物中加入冰水，搅拌至释出大量固体沉淀，抽滤、水洗、干燥，得黄色的粉末状固体，产率91.5%。m.p.:312.0-312.7 °C;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 12.39 (s,1H),8.37 -8.26 (m,2H),8.19 -8.11 (m,2H),7.98 (d,J=0.9 Hz,1H),2.18 (s,3H);HRMS m/z:calcd.for C11H10N3O3S [M+H]+264.04429,found 264.043835[8]。

1.2.2N-(4-(4-氨基苯基)噻唑-2-基)乙酰胺（2）的合成

将化合物（1）(2.64 g,0.010 mol)、二氯化锡二水合物[9](4.50 g,0.020 mol)溶于无水乙醇(50 mL) 中，反应混合物回流反应4 h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，残余物用CH2Cl2(40 mL×2)萃取，有机层分别使用 NaOH 溶液(1 mol/L,20 mL) 水(20 mL)洗涤，干燥，减压蒸馏除去溶剂，得淡黄色的粉末状固体，产率90.2%；m.p.:182.0-183.7 °C;1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 10.92 (s,1H),7.63 (d,J=7.9 Hz,2H),7.28 (dd,J=3.3,1.5 Hz,1H),6.95 (d,J=3.0 Hz,1H),6.73 (dd,J=7.9,3.9 Hz,2H),1.95 (t,J=2.9 Hz,3H);HRMS m/z:calcd.For C11H12N3OS [M+H]+234.07011,found 234.071242。

1.2.3N-(4-(2-乙酰氨基噻唑-4-基)苯基)-3-甲基苯甲酰胺（3）的合成

将N-(4-(氨基取代苯基)噻唑-2-基)乙酰胺衍生物（50 mg,0.123 mmol）、三乙胺（25 mg,0.246 mmol）和间甲基苯甲酰氯（0.184 mmol）[10]溶于CH2Cl2（30 mL）溶液中。室温下反应，TLC 监测反应结束后，将反应混合物分层，有机层依次用饱和NaHCO3溶液、盐水洗涤，用无水NaSO4干燥并减压蒸馏除去溶剂。残余物通过柱色谱法纯化[洗脱剂:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)＝50∶1]。White solid;Yield,83.8%;m.p.:154.5-156.4 °C;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 12.27 (s,1H),10.31 (s,1H),7.87 (t,J=6.2 Hz,4H),7.77 (d,J=7.3 Hz,2H),7.53 (s,1H),7.42 (d,J=5.4 Hz,2H),2.41 (s,3H),2.17 (s,3H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ 169.02,166.09,158.31,148.94,139.23,138.15,135.36,132.61,130.16,128.75,128.56,126.37,125.26,120.70,107.23,22.94,21.42;HRMS m/z:calcd.for C19H18N3O2S [M +H]+352.11197,found 352.112329。

1.3 晶体结构测定

取少量样品加到适量的甲醇回流使之溶解，静置至室温后，抽滤或倾倒上层清液置于干燥的小玻璃瓶中，再加少量甲醇使之不饱和，用滤纸封住瓶口，让其缓慢自然挥发。

1.4 以MTT 检测药物对细胞增殖的影响

本文采用MTT 法筛选了目标化合物对人肺腺癌细胞株A549、人结肠癌细胞株HT29 的细胞增殖抑制效果。实验步骤参照文献方法[11]。用GraphPad Prism 6 软件采用非线性回归法计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 乙酰氨基噻唑（化合物1）的合成研究

文献[12]报道，以溴代酮、硫脲和乙酸酐为原料，采用微波辐射一锅法合成了2-乙酰氨基噻唑衍生物。本实验重复此合成步骤，收率一般在75.3～81.2%之间。分析原因，可能是反应温度较高，硫脲和乙酸酐首先发生了一酰胺化反应，然后得到的乙酰基硫脲更易于形成共轭结构[13-14]，如图3 所示。

图3 硫脲的乙酰化反应

以α-卤代酮和硫脲作用是合成氨基噻唑类化合物的重要合成方法之一。反应的机理[15]为硫脲先形成亚胺结构，然后硫脲中的巯基与和α-卤代酮形成硫醚键，然合环、脱水形成了2-氨基噻唑衍生物（图4）。乙酰基硫脲结构中巯基的S 原子和氨基N原子，由于共轭作用电子密度减少，不易发生烷基化和合环反应。长时间的加热回流反应，使乙酰基硫脲易和乙酸酐继续形成二乙酰基硫脲[16]，导致合环产物收率降低。

图4 2-氨基噻唑衍生物的反应机理

本实验以溴代酮、硫脲为原料，先合环生成2-氨基噻唑衍生物，TLC 监测反应过程，然后在反应体系中继续加入乙酸酐发生乙酰化反应。

2.2 化合物（3）晶体结构数据

选取合适尺寸的单晶，利用Bruker AXS Smart APEX II CCD 型X 射线衍射仪测定，采用经石墨单色器单色化的MoKa 射线（λ=0.71073 Å）在296 ± 2 K 时收集数据，在2.50°≤θ≤25.02°范围内用以ω/2θ的扫描方式，收集衍射点。以差值傅立叶合成法定出非氢原子坐标，以各向异性热参数用全矩阵最小二乘法对其进行修正。晶体结构以直接法SHELXL-97 程序解出。单晶衍射晶体结构如图5所示，通过图6 晶体堆积图看出，化合物（3）依靠相邻分子之间-C=O… H 氢键形成多维结构，化合物（3）的晶体学参数列于表1。

图5 化合物（3）的晶体结构

图6 化合物（3）的晶体堆积图

表1 化合物（3）的晶体参数

2.3 抗肿瘤活性

为了考察目标化合物对肿瘤细胞增殖的影响，选择以索拉非尼（Sorafenib）为阳性对照药，测试结果如表2 所示。目标化合（3）对人结肠癌细胞株HT29 的细胞增殖抑制效果强于人肺腺癌细胞株A549，其对HT29 细胞的IC50值为23.37 μmol/L，具有进一步的研究价值。

表2 化合物（3）对肿瘤细胞增殖的影响

将RCSB PDB 数据库(http://www.rcsb.org)中下载的复合物晶体结构（PDB code 4asd），以配体Sorafenib（棍状模型）为模板，利用PyMOL 与本实验所设计的目标化合物（3）（线性模型）叠合。结果图7 显示，化合物（3）和模板Sorafenib 的骨架重合较好，但Sorafeinib 的末端酰胺片段和化合物（3）的乙酰氨基指向差距较大，另外，3-三氟甲基-4-氯苯基和3-甲基苯基比较，苯环上的取代基极性差别较大，这些差别可能导致了二者药理活性差别较大。