植物磷脂酶C在应答胁迫反应中的研究进展

赵阿慧 王宪国 董剑，2 侯佐 赵万春，2 高翔，2 杨明明，2

（1.西北农林科技大学农学院，杨凌 712100；2.陕西省小麦新品种培育工程研究中心，杨凌 712100；3.陕西省宝鸡市种子管理站，宝鸡 721006）

在自然界中，磷脂酶广泛存在，是一种能在特定酯键上水解磷脂底物的酶类，根据其底物中磷脂裂解键的位置可分为磷脂酶A1（phospholipase A1，PLA1）、磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）、磷脂酶B（phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（phospholipase D，PLD）（图1）［1］。这五种磷脂酶在结构、调节机制和功能上有很大差异，在信号转导［2］、动植物生长代谢［3-5］、细菌［6］和真菌［7］致病机制等方面也具有多样作用。其中，磷脂酶C参与动植物以及细菌信号通路，并发挥重要作用［8］。

PLC基因已经在动物、植物、酵母、细菌等多种生物中被鉴定。动物中的PLC基因分为6类和13个亚型，即 PLC-β1-4、PLC-γ1-2、PLC-δ1-5、PLC-ε、PLC-η1-2 和 PLC-ζ［9］。这些 PLC 基因的结构、作用机制、生理功能不尽相同，但它们对动物的生长发育、人类疾病治疗等方面都有重要的作用。植物中的磷脂酶C分为特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC）和非特异性磷脂酶C（nonspecific phospholipase C，NPC），PI-PLC主要水解磷脂酰肌醇类，生成2个信号分子，参与植物体内生长发育、信号转导、生物与非生物的胁迫响应及诸多其他功能；NPC的水解产物同样也能参与到植物的生长调节、介导信号通路及各种胁迫中，值得注意的是它在磷酸盐短缺中具有重要作用。本文就近年来植物中PLC的分类、结构、生化特性与生理功能研究进行总结，以期为植物PLC基因的功能研究提供帮助。

1 植物磷脂酶C的分类

磷脂酶C是一种重要的水解酶类，与植物的多种生理和抗逆功能有关。磷脂酶C根据其水解磷脂的底物不同，可分为PI-PLC和NPC［10-11］。其中PIPLC主要定位于细胞质膜上［12］，水解4，5二磷脂酰肌 醇（phosphatidylinositol 4，5- bisphosphate，PIP2）产生三磷酸肌醇（inositol 1，4，5- trisphosphate，IP3）和二酰甘油（1，2-diacylglycerol，DAG），DAG和IP3作为第二信使，在信号转导和级联扩大中起着重要作用［13］。同时，该基因受Ca2+的调控，在植物发育的不同的器官和组织、不同阶段，以及在各种非生物胁迫和生物胁迫条件下都有不同的表达模式。NPC可以水解磷脂酸（phosphatidic acid，PA）、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）等物质，从而生成DAG和头部带有磷酸基团的小分子化合物，在干旱、高盐、低磷等非生物胁迫下发挥重要作用［14-15］。目前，拟南芥基因组中有9个PI-PLC基因和6个NPC基因［16］，水稻基因组中有4个PIPLC基因和5个NPC基因［2，17］，番茄基因组中有6个PI-PLC基因，杨树基因组中有7个PI-PLC基因［18］，小麦基因组中有11个PI-PLC基因和15个NPC 基因［19］。

2 磷酸肌醇特异性磷脂酶C

2.1 磷酸肌醇特异性磷脂酶C的结构

PI-PLC的催化结构域X和Y两侧均有调控序列［20］（图2）。X、Y催化结构域和EF手型结构域在动植物中共有。所有PI-PLC的催化活性依赖于X、Y结构域，它们是磷脂酶C最保守的2个结构域。EF手型结构域由2-4个螺旋折叠的序列组成，可与底物和Ca2+结合，植物PI-PLC中只有后2个EF结构域，是否能与钙离子结合的机制有待进一步研究［21］。在植物应答外界生物胁迫的过程中，EF手型结构域还具有调控还原型辅酶Ⅱ氧化酶RBOHD的功能［22］。植物PI-PLC结构的最大特点是没有pleckstrin同源结构域（pleckstrin homology domain，PH 结构域），与动物中 PLC-ζ的结构相似［23］。C2结构域是PI-PLC都具有的一个结构域，它与Ca2+结合，引起磷脂酶C疏水性发生变化，并能优化膜催化核心的磷脂水解率［24］；C2结构域还选择性地去结合磷脂，如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、 磷 脂 酰 胆 碱（phosphatidylcholine，PC）和PE［25］。

2.2 磷酸肌醇特异性磷脂酶C的生化特性

PI-PLC对质膜起着至关重要的作用。PI-PLC的首选底物是PIP2，其次是磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphatidylinositol phosphate，PIP），然后是磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）。PIP2断裂产生DAG和IP3，DAG激活钙依赖性蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）［20，26］，然后磷酸化下游效应器，激活一系列细胞功能，包括调节细胞增殖、细胞极性和信号的空间分布。IP3是一个水溶性的小分子，它从细胞膜向外扩散，并通过胞质溶胶诱导胞内储存的Ca2+从内质网中释放出来。反之，细胞质中的Ca2+水平迅速升高，引起细胞信号激活的特征性钙峰。一旦内质网储备耗尽，它们就会通过储备的钙通道补充。Ca2+激活下游转录因子，进而激活多种基因的调控通路。PI-PLC信号通路可以调节植物细胞增殖、分化、受精、细胞分裂、生长以及基因表达的改变。

图2 PLCs 结构域简图Fig.2 PLCs domain diagram

高等植物PI-PLC属于PLC-ζ类，缺乏G蛋白调控的PLC-β或者PLC-ε型中的保守序列。PI-PLC通常被认为水解PIP2，产生IP3，通过配体门控受体释放细胞内Ca2+。然而，植物缺乏这种受体，并且与哺乳动物细胞相比，表现出极低的PIP2水平。同时植物基因组中缺乏PKC的同源序列，所以没有证据表明DAG在信号传导中起作用［27］。相比之下，有大量证据表明磷脂酸在植物中起着信号转导作用。植物中的DAG在盐、低温、高渗透等非生物胁迫和微生物病害等生物胁迫下被二酰甘油激酶（DAG kinase，DGK）磷酸化生成PA，而PA可以促进植物对逆境胁迫进行响应［16，28］。类似地研究证明，植物在受到干旱、脱落酸（abscisic acid，ABA）等非生物胁迫后，PA生成量有所增加，而PA是PI-PLC的特异性水解产物，所以间接证明PI-PLC有促进植物抵抗外界非生物胁迫的能力［29］。然而植物PIPLC及其反应产物的确切作用是什么，仍需要进一步研究。

2.3 磷酸肌醇特异性磷脂酶C的生理功能

据报道，PI-PLC参与了多种细胞发育和信号转导途径，以响应干旱、高盐、低温和高温等非生物胁迫和生物胁迫。如小麦、水稻、玉米、烟草、马铃薯、番茄和拟南芥等受生物胁迫及非生物胁迫过程中，一些PI-PLC基因的表达显示上调或下调。另外，研究发现，增加特定的PI-PLC基因表达量也可以显著改善植物对盐、干旱及激素等的耐受性。因此，PI-PLC基因是未来产生耐逆高产作物品种的潜在遗传操作候选基因。

2.3.1 非生物胁迫

2.3.1.1 渗透胁迫 NaCl/KCl和甘露醇、山梨醇等渗透胁迫诱导剂引起IP3水平在短时间内快速升高，并在抗渗透胁迫方面具有积极作用［30-32］。Deng等［33］发现水稻OsPI-PLC4影响渗透胁迫诱导的PA、IP3和Ca2+等含量的变化，并积极调节水稻对盐和干旱的反应。在植物渗透胁迫期间，会快速触发Ca2+信号，这可能会激活SOS（盐过度敏感）途径，将Na+挤出细胞，从而减少细胞质中有毒Na+的数量。这表明OsPI-PLC1通过调节盐胁迫诱导的Ca2+信号的形成而促进水稻的耐盐性。同时，在盐胁迫的条件下，水稻和拟南芥中PI-PLC基因的表达量会增加［34］。其中，AtPI-PLC1参与不依赖ABA的高渗胁迫信号转导；AtPI-PLC2参与内质网胁迫反应和生长素调节的生长发育；AtNPC4可以提高拟南芥对高渗透胁迫的抗性［35］。

脯氨酸是一种渗透调节物质，在植物体内积累以减轻渗透胁迫作用。在拟南芥中，PI-PLC水解产生IP3调节钙离子释放，随后导致脯氨酸积累，以响应钙离子，而非离子高渗胁迫［36］。然而，在盐和渗透胁迫条件下，PI-PLC对细胞渗透压水平有积极的影响［37］。ABA是一种重要的植物应激激素，在胁迫下积累，控制许多植物防御反应［38-39］。在植物中，PI-PLC似乎积极参与ABA依赖的信号传递，如AtPI-PLC6可以被ABA诱导表达上调，AtPI-PLC6、AtPI-PLC7和AtPI-PLC8的表达量可以被生长素、细胞分裂素、盐胁迫、干旱胁迫和冷胁迫诱导上调表达［16，40］。

2.3.1.2 低温胁迫 磷脂酶是将磷脂水解成脂肪酸或亲脂物质的酶。它们通过改变质膜脂质成分影响低温和抗冻性［41］。在低温胁迫下，植物中几种基于磷脂的信号途径被迅速激活。这些途径包括PLD和PLC与DGK（PLD&PLC/DGK）结合，直接或间接导致PA的产生［28］。近年来，PA已被确认为是参与调节植物、动物和真菌细胞生长、发育和应激反应的重要细胞介质［42-44］。PA包含一小类膜脂，其中磷酸甘油与2个脂肪酸链酯化。PA的含量和分子形式对植物的抗寒性和抗冻性有重要影响。在ABA处理的拟南芥叶片中，PA的含量增加了大约50%［45-46］，而在冷冻过程中，拟南芥叶片中的PA水平升高了5倍以上［47］。此外，徐小静等［48］通过冷胁迫处理拟南芥幼苗发现，AtPI-PLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导，AtPI-PLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应；玉米中ZmPI-PLC5在低温胁迫下表达量上调［49］。

2.3.1.3 干旱胁迫 钙调蛋白、G蛋白、PLC、PLD及蛋白激酶等间接参与水分胁迫的信号转导，从而起到应对干旱胁迫的作用［50-51］。当在干旱胁迫或者盐胁迫下，小麦TaPI-PLC1［52］、绿豆VrPIPLC3［53］、烟草 NtPI-PLC1、马铃薯 StPI-PLC1 和 StPIPLC2［54］等基因上调或下调表达。也有研究表明干旱胁迫下，PI-PLC和肌醇六磷酸（inositol 6-phosphate，IP6）参与ABA信号传递和调节气孔开闭［55］。拟南芥中的AtPI-PLC2通过控制水杨酸（sclicylic acid，SA）和茉莉酸甲酯（jasmonic acid，JA）的含量控制PA的生成，进而抵抗干旱胁迫［56］。

2.3.1.4 热胁迫 高温对植物的生长发育造成严重影响，在热胁迫下，细胞膜流动性和钙离子信号途径和产地高温信号密切相关，这些信号的传导成为耐热性的关键步骤。在热激反应中，IP3与受体结合引起钙离子浓度瞬间变化，并通过一系列途径使热激转录因子激活热激蛋白的表达，进而参与植物对高温胁迫的适应［57］。在豌豆中，热胁迫激活PLC的表达并且与水杨酸共同参与耐热调控［58］。在番茄中，热处理后，PLC3和PLC6显著上调表达［7］。AtPLC3和AtPLC9在拟南芥中参与耐热中的作用也被报道［57，59］，AtPLC3缺失突变体热处理 1 h后，与野生 型 相 比，AtHSP18.2、AtHSP25.3、AtHSP70-1和AtHSP8-3均下调表达30%，而在AtPLC3过表达的转基因拟南芥中，4个蛋白的表达均提高1.5-2.0 倍，表明PLC3基因可能是通过调节HSP的表达来提高拟南芥的耐热性［60］，敲除AtPLC9使拟南芥耐热性降低，而过表达AtPLC9可以进一步提高拟南芥的耐热性，同时敲除AtPLC3和AtPLC9与单突变体相比会进一步降低拟南芥的耐热性［59］。小麦分子生物学实验室前期研究结果发现，小麦在热处理下，小麦PLC基因的表达量显著提高，在PLC蛋白抑制剂U73122处理下，PLC基因的表达量降低，小麦幼苗对热胁迫的敏感性增强［61］。而关于PLC基因参与的耐热调控机制，可能是通过改变钙离子浓度，进一步调控热激转录因子与热激元件的结合活性，从而影响热激蛋白的合成和表达［34］。

2.3.1.5 其他胁迫 在植物中，还有一些胁迫信号通过PI-PLC途径在植物细胞中传递。低氧诱导水稻根系快速积累与G蛋白无关的IP3。这种PLC的激活通过IP3敏感的钙通道、钙离子和钙调素进一步传递，这些钙离子和钙调素是在厌氧胁迫期间γ-氨基丁酸积累和细胞钾流失所必需的［62］；在铝处理后的咖啡悬浮细胞中，能快诱导IP3积累［63］，油菜根体内铜过量能迅速增加DAG的积累［64］，而IP3和DAG间接反映PI-PLC的活性。

2.3.2 生物胁迫 植物固有免疫使植物对潜在的传染性病原体（病毒、细菌和真菌）有抵抗力。激活植物防御的免疫原性信号有多种形式。磷脂酶和磷脂衍生分子被认为是免疫防御形式的内在组成部分［65-67］。

在生物胁迫下，PI-PLC基因的转录激活是常见的。在番茄中，一些PI-PLC基因家族成员被确定为植物防御系统的关键组成部分［7］，SlPI-PLC4和SlPI-PLC2表达量下调，则损害木聚糖酶的功能［68-69］。在生物胁迫条件下，SlPI-PLC4和SlPI-PLC6对番茄抗黄曲霉菌、大丽花黄萎病菌和丁香假单胞菌的过敏反应和植株抗性的发生具有显著的调控作用。在拟南芥中，AtPI-PLC2突变体的根对衣霉素诱导的内质网应激反应更加敏感［55］。以上结果都表明PI-PLC参与了植物对生物胁迫的响应。综上所述，植物PIPLC在响应不同胁迫的信号转导中发挥着重要作用，是细胞调控系统复杂网络中的一个关键中枢。然而，PI-PLC基因在非生物和生物胁迫响应中的作用机制等尚需进一步研究。

3 非特异性磷脂酶C

3.1 非特异性磷脂酶C的结构

当植物NPC首次被发现时，它们与任何其他已知的植物磷脂酶家族成员没有关系。通过比对拟南芥NPC与结核分枝杆菌PLC，发现3个与已知植物磷脂酶区域无关的保守区域［14］。虽然NPC亚家族在进化中出现得很早，但细菌、植物和无脊椎动物的谱系都有各自不同的NPC序列特征。NPC蛋白虽然没有其他植物磷脂酶家族成员含有的C2、X、Y、EF-hand等结构域，但它包含一个中心磷酸酯酶结构域，该结构域通常存在于具有酯酶活性的酶中，如NPC和酸性磷酸酶，可以水解磷脂，因此，NPC被归为PLC的一个亚家族［70］。

3.2 非特异性磷脂酶C的生化特性

NPC是PLC的一种亚型，它能水解一系列膜磷脂［71］，如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油和磷脂酸［72］，并生成DAG和带有磷酸基团的头部。NPC首先在致病细菌Cl.welchii中发现［73］，它具有卵磷脂酶C一样的活性，能导致宿主细胞质膜溶解。因此，NPC也被称为PC-PLC，但细菌PI-PLC属于分泌性致病因子，且通常具有毒性［74］。随后NPC作为具有信号功能的新型磷脂酶在植物欧芹和烟草细胞中被鉴定［75］。与PI-PLC只用PIPs作为底物不同，NPC的底物广泛，主要是膜磷脂类，如PC和PE作为底物，不水解PIP2。AtNPC4和AtNPC5的重组蛋白表明PLC对PC和PE的活性［76］。同样，最近克隆的AtNPC2和AtNPC6对PC和PE的活性几乎相同［77］。对AtNPC2、AtNPC4和AtNPC6进行了PA水解测试，但均未显示出显著的磷酸酶活性［77-78］，这表明NPC是一种磷酸二酯酶。然而，AtNPC3被证明具有PA磷酸酶的功能，尽管其氨基酸序列与其他NPCs高度同源［79］。值得注意的是，水稻OsNPC1被证明用PC和双半乳糖基甘油二酯（digalactosyldiacylglycerol，DGDG）作为底物［80］。另外，Cai等［81］表明在拟南芥中 AtNPC6 水解单半乳糖二酰基甘油（monogalactosyldiacylglycerol，MGDG）和DGDG。因此，需要进一步的生化和酶学研究来阐明底物特异性的分子机制。

3.3 非特异性磷脂酶C的生理功能

NPC活性在干旱、低温等非生物胁迫以及生物胁迫下会发生变化。在植物细胞中，对Al、油菜素类固醇和激发子的反应，NPC活性和DAG的产生发生了快速变化。在快速启动子的控制下，这些反应比从头合成蛋白质要快［82］。NPC活性的变化可以归因于通过翻译后修饰或细胞内易位刺激预合成的酶。因此，NPC在植物细胞中具有一定的生理作用。

3.3.1 非生物胁迫 棉花GhNPC3仅在盐胁迫下优先表达。水稻中OsNPC2对盐更敏感，在盐胁迫下其表达量增加了近8倍。拟南芥在盐胁迫下幼苗根中NPC4表达量增加了12倍，提高了NPC活性以增加DAG的产量［83-84］。此外，在盐胁迫和高渗透条件下，过表达AtNPC4的转基因株系具有较高的萌发水平，并能保持更大的根长和干重［71，85］。AtNPC5-1突变体在轻度盐胁迫（75 mmol/L NaCl）下产生的侧根较少［86］。因此，NPC5可能参与了轻度盐胁迫下侧根的发育。

拟南芥幼苗在37℃热胁迫处理2 h后，AtNPC3的表达水平增加14.6倍［87］，表明NPC在植物耐热性方面起着重要作用。AtNPC1缺失突变体显示基础耐热性受损，而与野生型相比，AtNPC1的过表达增强了植株对高温胁迫的抵抗力［88］。在荧光PC培养的烟草By-2细胞中，热胁迫增加了荧光DAG的产生，这表明NPC活性是由热胁迫诱导的。棉花GhNPC5和GhNPC9在高温胁迫下被强烈诱导［89］。以上发现为理解NPC在热应激反应中的潜在作用提供了一些线索。

铝的毒性可通过细胞膜去极化、破坏离子通量和钙稳态快速抑制根系生长，并影响细胞骨架［90-91］。某些磷脂酶和脂质中间体在铝胁迫中起信号传导或代谢作用［92］。烟草By-2经过Al处理过后其细胞中DAG积累的减少依赖于NPC活性，表明DAG在铝胁迫中发挥了重要作用［93］。

NPC与PLC最大的不同在于NPC对磷酸盐短缺的响应。在磷酸盐短缺时，有机磷酸盐可以从膜磷脂中被动员，膜磷脂吸收了植物细胞中1/3的磷。NPC能够通过将含磷酸盐的头基团从磷脂酰胆碱或其他磷脂中分离来促进这种活动［94-95］。在磷酸盐缺乏的情况下，拟南芥中PC含量的短暂增加伴随着DAG的快速下降，表明AtNPC4被激活［96］。AtNPC4在缺乏磷酸盐的拟南芥中得到了较高的表达［14］。AtNPC5表达量增加，T-DNA突变体的AtNPC5在磷酸盐缺乏期间DGDG积累减少，PI缺失导致拟南芥根中的NPC5特异性激活［97］。有趣的是，虽然AtNPC4和AtNPC5的表达水平在磷酸盐饥饿期间被显著诱导，但磷酸盐摄取的恢复导致其转录被快速抑制［98］。AtNPC3敲除突变体表现出了由磷酸盐缺乏诱导的侧根生长的弱损伤［99］。植物NPC无疑出现在磷酸盐限制条件下的脂质重塑的关键酶中。

3.3.2 生物胁迫 磷脂酶在植物应对生物胁迫调节机制中起着重要作用［100］。Scherer等［75］分别研究了大豆疫霉菌糖蛋白诱导子和烟草隐球菌诱导子在香菜细胞系和烟草细胞系中的作用，首次证明了NPC诱导子可能在植物防御反应中的信号转导作用。在2个脂肪酸残基上添加合成的PC荧光标记到细胞培养物中，发现荧光标记的DAG产量迅速下降，表明NPC活性受到抑制。在使用mastoparan（一种能够激活G蛋白的肽）治疗后，DAG水平也出现下降。观察到的荧光标记PA水平不显著，说明荧光DAG主要来源于NPC的直接作用，而不是PLD和PAP（PA phosphatase）的激活［70，75］。

不同菌株的丁香假单胞菌和寄生假单胞菌接种后，AtNPC基因家族（特别是AtNPC6）显著下调，这代表了兼容和不兼容的植物-病原体相互作用［70］。然而，AtNPC3和AtNPC4对灰霉病、灰霉病、丁香假单胞菌和疫霉菌侵染有阳性反应［16，99］。AtNPC5的同源基因在侵染亚洲念珠菌后的柑桔植株中表达量增加了4倍［98］。此外，AtNPC1和AtNPC4对细菌来源的激发子（flg22和HprZ）有反应，这表明NPC在应激反应和感知不同激发子的能力中可能具有二价功能［71］。在拟南芥突变体中，烟粉虱感染期间和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）处理后，AtNPC3表达均升高，表明AtNPC3可能参与了对害虫的防御反应［70］。

4 展望

从植物PLC的结构来看，植物与动物PLC中最简单的PLCζ结构相似，缺少除EF-hand、XY保守域和C2域以外的结构域，且EF结构只有2个螺旋折叠的序列，但在动物里都有4个（除PLCζ），植物缺少的PH结构域，在与底物结合时有重要作用；从调节机制看，植物中没有发现IP3受体，也没有发现DAG能够激活特异性的的蛋白激酶，大量研究表明其下游产物PA是响应盐、高渗、干旱等非生物胁迫的关键产物；植物中的调节机制有待进一步研究，PLC水解产生的DAG与IP3与下游的PA及Ca2+之间的直接联系尚待进一步研究证明，Ca2+能否直接激活PLC发挥作用也没有证据表明，且PA的功能结构域也并没有完整定义，还有些人认为PA和IP6是植物体内的二级信使，具体机制也有待研究。这些方面的探究对于PLC的深入挖掘具有重要意义，一方面能填补PLC在这些领域的空白；另一方面也能为高效优质育种做出贡献。