无菌猪和普通猪早期脂肪发育及脂肪组织基因转录表达的差异

2021-06-23邱小宇刘作华齐仁立

生物技术通报 2021年5期

邱小宇刘作华，2 齐仁立，3

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.农业农村部养猪科学重点实验室，重庆 402460；3.重庆市养猪科学重点实验室，重庆 402460）

动物的胃肠道内寄居着数量巨大、种类繁多的微生物，包括细菌、真菌、古菌、病毒等，其中90%以上为细菌，涵盖了数千种不同的菌属［1］。成年猪的肠道细菌数量高达1014CFU/g，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidete）细菌占全部肠道菌的95%以上［2］。肠道菌群按照一定比例共存，相互依赖、相互约束，最终在宿主体内形成一个复杂的微生态系统［3］。现有的研究发现，肠道微生物可以调控宿主体内多个组织或器官的发育与成熟，如肠道、肝脏、大脑、免疫系统等都会受到肠道微生物的直接或者间接影响［4-6］。而肠道微生物的失衡以及有害细菌的侵袭则会破坏宿主体内的生理稳态，甚至会导致宿主出现肥胖病［7］、糖尿病［8］、帕金森病［9］和抑郁症［10］等多种疾病。

脂肪组织是动物机体重要的组织器官，功能包括：调节体温、保护内脏器官，作为“燃料库”为动物储存和提供能量。脂肪还可以通过多种方式（吸收脂溶性维生素、供给必须脂肪酸、分泌多种细胞因子等）干预和调控体内其他组织器官的生理功能［11-12］。当前，大量的研究结果表明，肠道微生物主要通过两种方式影响宿主脂肪组织的发育和功能：（1）直接影响宿主消化道内多糖等物质的发酵以及能量物质的产生与获取［13］；（2）经由细菌代谢物（如短链脂肪酸等）调控脂肪代谢相关基因的表达进而影响脂肪细胞分化和成熟［14］。然而，目前肠道微生物干预和调控脂肪发育的研究多集中在无菌小鼠、悉生小鼠等啮齿类模型动物上，对猪、牛、羊等具有重要经济价值的家畜上的相关研究还相对较少。

无菌动物是研究肠道微生物调节宿主生长发育的重要模型工具。在以往的研究中，无菌猪主要用于探索肠道微生物群对免疫系统发育和成熟的影响［15-17］，而利用无菌猪来揭示肠道微生物群对猪脂肪组织发育的相关研究鲜有报道。此外，由于猪的肠道微生物组成和代谢模式与人有着较高的生理相似度［18］，因此基于猪肠道微生物的研究对人的生理和病理相关研究也会具有一定指导意义。本研究选用无菌仔猪（germ free piglets，GF piglets）和普通带菌仔猪（normal piglets）进行比对分析，比较两种猪的脂肪组织形态、功能和基因表达的差异，揭示肠道菌定植对仔猪早期脂肪沉积和脂肪代谢的影响。研究的相关结果对于通过肠道微生态平衡改善动物生长和生产性能、维持动物生理健康能提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择无血缘关系，身体健康，外观无异常，血清检测猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、布鲁氏菌、猪肺炎支原体、猪流感病毒等病原微生物均为阴性的妊娠母猪在预产期前3 d进行无菌剖腹产手术（无菌猪模型制备参照中国实验动物学会团体标准TCALAS71-2019执行，3头无菌猪由重庆市畜牧科学院无菌猪研究平台提供）。将剖腹获得的无菌仔猪饲养于无菌的隔离器内。无菌猪的饮用水和配方奶粉均经过60Co辐照且微生物检测合格（饲料、饮用水微生物检测参考孙静等［19］的方法执行）。无血缘关系的3头普通仔猪在标准化的饲养环境中出生和生长，正常母乳喂养，常规饲养管理。

1.2 方法

1.2.1 样品采集在25日龄时，3头无菌仔猪和3头普通仔猪分别通过异氟烷呼吸麻醉，放血处死，在洁净环境内进行采样。迅速切开仔猪颈部皮肤组织，使用游标卡尺测量颈部皮下组织的脂肪厚度。用无菌剪刀采集1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小的颈部皮下脂肪组织，预冷的生理盐水漂洗3次后，分别放入4%中性甲醛中固定和液氮速冻后-80℃冰箱保存。

1.2.2 石蜡切片和HE染色将固定24 h后的脂肪组织从4%的甲醛溶液中取出，用超纯水反复冲洗12 h后置于75%乙醇内，用70%、80%、90%、100%的梯度乙醇脱水，脱水后使用二甲苯透明、石蜡溶化后包埋，切成3 μm-5 μm厚的薄片后行进行HE染色，蒸馏水洗5 min，苏木精染色6 min，自来水洗净，分化液20 s，水中浸泡20 min返蓝，1%伊红质染1 min，自来水冲洗，脱水、透明、封片，置于显微镜下观察脂肪组织细胞直径大小和脂肪沉积差异。

1.2.3 蛋白提取和免疫印迹杂交脂肪组织液氮研磨成粉末状后，加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA蛋白裂解液，4%摇床过夜。充分裂解后，12 000 r/min，4℃离心5 min，吸取上清液并检测蛋白浓度。将所有蛋白样品调至等浓度，加入Loading buffer充分混匀，98℃金属浴10 min后进行SDS-PAGE电泳与转膜。转膜后用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入目标蛋白的一抗，4℃孵育过夜。第2天用TBST室温摇洗3次，每次5 min。加入HRP标记二抗，室温孵育1 h，TBST摇洗3次，每次5 min。使用ECL反应试剂盒，化学发光自动成像仪曝光拍照。Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.2.4 酶联免疫检测脂肪组织加入适量预冷的生理盐水研磨粉碎，1 000 r/min离心后取上清液，置于-20℃保存待测。使用ELISA检测试剂盒测定脂肪细胞因子-脂联素（adiponectin）和瘦素（leptin）的含量（上海酶联生物有限公司），操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.5 转录组测序与生物信息学分析使用试剂盒提取脂肪组织总RNA，Nanodrop 2000检测RNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测完整性，Agilent2100测定RIN值。利用带有Oligo（dT）的磁珠分离mRNA，通过Illumina HiSeq平台对其序列进行测序。测序完成后，对所获得的测序数据进行质量控制，去除含有接头的reads、全部都是A碱基的reads、含N比例大于10%的reads和低质量的reads（质量值Q≤20的碱基数占整条reads的50%以上）。

使用比对软件Tophat2（2.1.1）将得到的序列对比到猪的参考基因组上。利用FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）计算法，统计转录本的表达量及其分布情况，并根据FPKM值分析样本两两之间的相关性。差异表达基因筛选采用DEGseq2软件并以RPKM（reads per kilobase transcriptome per million mapped reads）计算方法进行，筛选条件为P＜0.001，FC＞2，至少一组中的RPKM＞1（FC为3个样品表达量的平均值）。对筛选出的差异基因进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，应用超几何检验寻找显著性富集的通路，确定差异表达基因参与的主要生化代谢途径和信号转导通路。

1.2.6 qRT-PCR验证转录组测序结果从转录组测序的结果中挑选具有明显表达变化的脂肪代谢相关调控基因，使用qRT-PCR的方法进行验证。将测序所用的total RNA样品使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa，日本）试剂盒反转录为cDNA。使用Q6荧光定量PCR仪（AB 公司，美国）进行PCR反应，反应条件：95℃预变性30 s；（95℃ 5 s，60℃35 s）40 个循环。U6 为参照基因，2-△△CT法计算基因的相对表达量。

1.2.7 数据统计实验数据以Mean±S.E.形式表示，用Graphpad Prism 7.0软件进行Student t检验和作图。*P＜0.05为显著，**P＜0.01为极显著。

2 结果

2.1 无菌猪和普通猪的脂肪组织发育比较

图1-A显示了普通仔猪和无菌仔猪脂肪细胞的形态差异。与具备完整肠道微生物的普通仔猪相比，相同日龄无菌仔猪的脂肪沉积量明显较少。无菌仔猪的颈部皮下脂肪厚度、脂肪细胞直径显著低于普通仔猪（P＜0.001；图1-B，图1-C）。脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（peroxisome proliferators activated recepor γ，PPARγ）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是参与脂肪合成与沉积重要调控因子。Western blot分析表明，无菌仔猪脂肪组织中FABP4、PPARγ、ACC、FAS的蛋白表达量都显著或极显著低于普通仔猪（图2-A），提示无菌仔猪在脂肪合成代谢方面显著弱于普通仔猪。

图1 无菌仔猪和普通仔猪脂肪沉积的差异Fig.1 Difference of fat deposition between GF pigs and normal pigs

脂联素（adiponection）和瘦素（leptin）是脂肪组织分泌产生的两种最为重要的细胞因子。试验结果表明，相比于正常仔猪，无菌猪的脂肪组织中脂联素和瘦素的含量均不同程度降低（P=0.100，图2-B；P=0.095，图2-C）。这个结果一定程度上反应了无菌仔猪脂肪组织生理功能的减弱。

2.2 转录组（RNA-seq）测序结果

经RNA-seq分析，在无菌猪和普通猪上平均得到53 472 016条和59 866 864条原始测序序列（Raw reads）。去除低质量的序列后，普通猪上得到干净序列（Clean reads）59 285 399条（均值，下同），占总序列数的99.02%；无菌猪上得到干净序列52 961 306条，占总序列数的99.04%。将Clean reads与猪的参考基因组基因序列比对，平均有48 033 697条序列比对猪参考基因组上（比对率＞85%）。其中，无菌猪和普通仔猪上的唯一比对序列分别占总比对序列的77.98%和79.43%（表1）。

图2 无菌猪和普通猪的脂肪合成调控分子表达和脂肪细胞因子含量的差异Fig.2 Differences in fat synthesis regulatory factors and adipocytokines between GF pigs and normal pigs

2.3 无菌仔猪和普通仔猪脂肪组织基因表达情况

如图3所示，6个RNA文库样本测序数据对基因覆盖度好，无两端倾向性，反应了测序数据完整性及可信度高。对得到的转录本信息进行功能注释，在无菌仔猪和普通仔猪共确认了15 711个已知基因。将所有基因的表达水平进行归一化处理后，分析并绘制无菌猪和普通猪的基因整体表达水平分布图和样本间基因相关性热图。结果显示两组的全部基因表达量整体差异不明显，样本间基因表达相关性好，反应实验和样本选择的可靠，可应用于后续的差异基因筛选与分析（图4）。

表1 测序数据基因组比对统计Table 1 Statistical list of mapping to genome

图3 样本测序基因覆盖度Fig.3 Coverage of sequencing

2.4 差异表达基因及qRT-PCR验证

韦恩分析显示13 747个基因在两种猪上共表达，764个基因仅在普通仔猪中表达，1 200个基因仅在无菌仔猪中表达（图5-A）。去除了低表达基因（FPKM＜1），然后根据变化倍数（fold change）＞2和P＜0.001的标准筛选差异表达基因（differently expressed genes，DEGs）。结果显示，无菌仔猪和普通仔猪的脂肪组织有695个DEGs，其中表达上调基因338个，表达下调基因357个（图5-B 和5-C）。表2显示了无菌仔猪脂肪中差异最显著的10个上调基因和10个下调基因。其中，与脂肪转运、合成以及代谢相关的基因：LIPG、SucCβ、PIK3C2G、CYP1A1；与炎症反应相关的基因：PRG4；与营养能量代谢相关的基因：MAPKAPK；与氨基酸合成相关的基因：NRIP3、C4BPA。

图4 样本基因表达分布和相关性Fig.4 Distribution and correlation of genes expression patterns in different samples

通过qRT-PCR方法对测序中得到一些脂肪代谢调控关键基因的表达变化进行验证，PCR结果与转录组测序的结果基本一致（图6）。与普通猪相比，无菌猪体内一些调控脂肪分解代谢的基因如ATGL，UCP3表达显著上调，此外，负责脂质吸收、转运的基因如CD36和FATP1的表达水平也被上调，而涉及脂肪合成代谢的调控基因（PPARG和CEBPA）的表达则不同程度下调。

表2 十个表达差异最显著的上调和下调基因Table 2 Top 10 up or down expressed genes

图5 差异表达基因Fig.5 Differentially expressed genes

图6 差异表达基因的qRT-PCR验证Fig.6 Verification of the differentially expressed genes by qRT-PCR

2.5 差异表达基因的KEGG富集分析

将测序得到的所有差异表达基因进行KEGG通路富集分析，进一步揭示带菌猪和无菌猪脂肪代谢的差异分子网络。图7分别显示了无菌猪脂肪组织中表达上调和表达下调基因富集的KEGG通路（富集显著性前20位）。表达上调基因主要富集于脂肪分解、脂质代谢（sphingolipid，glycerolipid，ether lipid等）、PPAR信号通路；而表达下调基因主要与免疫功能、细胞生长、物质代谢（糖代谢、脂类合成、氨基酸合成）和能量稳态有关，主要包括细胞周期、糖酵解、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、MAPK信号通路等。这些结果说明缺少肠道菌的存在，仔猪体内的物质分解代谢和能量消耗大于能量蓄积和合成代谢，这些代谢的差异引起脂肪生长和发育迟缓。

3 讨论

脂肪是动物体内存储能量的重要组织，脂质合成与沉积同动物体内营养物质的消化、吸收、代谢和能量周转有着直接的关系［20］。在家畜中，脂肪组织的生长发育对于动物产品品质（肉、蛋、奶）也有重要的影响。早在2004年，肠道微生物首次被证实对宿主的脂肪组织发育具有重要的调节作用［21］。而随着研究的深入，研究者们发现肠道微生物与动物的脂肪沉积存在直接的联系［22］。如Turnbaugh等［23］给体况相近的成年无菌小鼠接种肥胖或瘦的小鼠肠道微生物，饲养14 d后发现接种肥胖小鼠肠道微生物的无菌小鼠体脂含量分别比接种瘦小鼠肠道微生物的无菌鼠和未接种的无菌鼠体脂含量增加了20%和47%。然而目前大多数针对肠道微生物调控宿主脂肪发育的研究都基于啮齿类动物模型。猪作为一种自然界肥育度最高的动物，是研究肠道微生物调控脂肪发育和脂质代谢的天然有利模型。研究肠道微生物对于猪脂肪组织的影响不仅能补充我们对肠道微生物生理调控功能的认识，也会为下一步通过微生物手段来改善猪肉品质奠定新的理论基础。本研究中，我们通过直接比较无菌仔猪和普通仔猪，发现无菌猪的体脂沉积量、脂肪细胞尺寸、脂肪细胞分泌功能均弱于普通仔猪，说明了肠道菌群的缺失导致宿主脂肪发育不良。

近年来，基于无菌动物模型、菌群移植技术、宏基因组等多种研究技术，肠道微生物与宿主脂肪组织发育之间的联系正在被逐渐揭示。肠道微生物影响脂肪组织发育可能涉及多种不同的机制。（1）肠道微生物可以调控胰岛素等激素的分泌影响脂肪的生长发育［24］。（2）多数情况下，肠道微生物是通过产生和释放代谢产物如短链脂肪酸、生物胺、细菌素等物质进入循环系统，到达并作用于脂肪细胞和脂肪组织，影响脂肪组织代谢［25］。（3）肠道微生物还能通过“微生物-肠-脑轴”调控大脑的营养感知、激素分泌、神经信号传导，进而改变宿主的食欲、采食量、生长节律、物质代谢和能量周转平衡，影响脂肪组织的发育［26-28］。（4）在一些特殊病理或者炎症情况下，肠道菌群能突破肠道屏障，通过“肠漏”逃逸到脂肪组织，直接刺激和影响脂肪细胞［29］。其中，短链脂肪酸是目前研究较多的肠道菌重要代谢产物，除了作为能源底物直接被肠道吸收，它们也可以作为信号分子激活靶器官的G蛋白偶联受体GPCR41和GPCR43，促进瘦素等激素的分泌，调控宿主的糖脂代谢和脂肪组织胰岛素敏感性［30-31］。本研究中，我们在无菌猪的脂肪组织上也观察到瘦素和脂联素分泌量的减少和G蛋白偶联受体家族基因（GPCR）的表达下调，可以推测无菌状态下，肠道内产生的短链脂肪酸大量减少进而导致脂肪组织分泌功能的降低。

图7 差异表达基因的KEGG功能富集Fig.7 KEGG enrichment analysis of the differentially expressed genes

伴随着脂肪组织形态和功能变化的是分子层面的巨大差异。我们通过高通量测序解析了无菌猪和普通猪的脂肪组织基因表达谱的差异，这为进一步探索肠道微生物调节猪脂肪组织发育的分子机制奠定了基础。本研究结果显示无菌猪的脂肪中，表达变化最显著的差异基因主要与免疫、炎症、脂肪和能量代谢直接相关。如已有文献报道能催化ATP水解和具有抑制肠上皮细胞屏障功能的MAPK激酶蛋白酶（MAPK-Activated Protein Kinases，MAPKAPK）［32-34］、能在炎症条件下被急剧上调来稳定细胞外基质的α-胰蛋白酶抑制剂重链3（Interα-trypsin inhibitor heavy chain 3，Itih 3）［35-36］以及与氨基酸转运代谢和氧化还原酶活性正相关的苯丙氨酸4-单加氧酶（phenylalanine 4-monooxygenase）都显著表达上升［37］，而能激活糖原合成酶，促进肝糖原的合成，增加甘油三酯的生成的磷脂酰肌醇3激酶复合物（phosphatidylinositol 4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing subunit gamma，PIK3C2G）［38］、有助于高密度脂蛋白/低密度脂蛋白/极低密度蛋白通过内吞进入细胞内产生分解反应并为细胞提供脂质合成必需的脂质前体以及具有一定抗炎症作用的内皮脂肪酶（endothelial lipase，LIPG）［39］、有着胆固醇水解活性和甘油三酯水解酶活性的羧酯酶1（carboxylesterase 1，CES1）［40-41］以及能抑制 LPS 诱导的炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6表达的细胞色素P450 1A1（cytochrome P450 1A1，CYP1A1）均显著下调［42］。

在啮齿类动物类动物模型上，Backhed等［43］的研究发现无菌小鼠的能量利用和消耗高于普通小鼠。同样地，通过转录组分析我们发现无菌猪的能量代谢强于普通仔猪，但脂肪发育上却弱于普通仔猪。如无菌猪中上调表达的差异基因显著富集于脂肪分解、糖代谢和能量利用，如脂肪细胞脂解调控信号通路（regulation of lipolysis in adipocytes）和糖异生相关的cAMP信号通路（cAMP signaling pathway）等，而下调表达的基因则更多的与免疫、炎症、细胞生长和物质合成代谢有关，如具有调节器官发育、组织稳态以及脂代谢功能的关键信号通路Hippo 信号通路（hippo signaling pathway）、与细胞生长、发育、葡萄糖稳态相关的PI3K-Akt信号通路以及与不饱和脂肪酸合成相关的不饱和脂肪酸合成信号通路（biosynthesis of unsaturated fatty acids signaling pathway）。这些研究结果再次强调了正常的肠道菌群对于维持和促进宿主动物的脂肪代谢和脂肪组织发育是非常必要的。