miR-21a-5p 靶向MATN2抑制LPS诱导的巨噬细胞损伤的实验研究

王立刚 王 颖 王 涵

脑卒中(cerebral stroke)又称中风、脑血管意外，是一种发生率、病死率及致残率都较高的急性脑血管疾病，其中缺血性脑卒中占比高达80%，严重危害人类生命健康[1,2]。缺血性脑卒中主要由脑部血管阻塞导致脑血供不足，引起内质网功能障碍、氧化应激、神经炎症级联反应和兴奋性毒性等病理变化导致神经细胞死亡，造成严重的神经损伤[3～5]。脑卒中发生后，浸润性巨噬细胞介导的神经炎性级联反应在调节缺血性脑损伤中发挥关键作用，影响脑卒中后神经元的命运和脑组织的微环境稳态[6,7]。重组组织纤维溶酶原激活剂(r-tPA)是目前常用的脑卒中临床治疗方案，但由于其治疗时间窗窄，出血伤害风险大，限制其临床应用[8]。因此，深入研究脑卒中调控机制并开发新的靶向治疗方法显得尤为重要。

miRNA是一类长度为21～23nt的寡核苷酸RNA，通过与RNA互补序列结合来调节特定RNA的翻译，从而引起mRNA降解或螯合，调控多种细胞生理过程，是一类重要的转录后调节因子[9,10]。最近研究表明miRNAs参与调控脑卒中病理进程中的炎性反应[11,12]。Zhang等[13]通过体内体外研究发现miR-146a-5p靶向抑制Notch表达，促进巨噬细胞向M2型转化，分泌抗炎性细胞因子IL-10和Arg-1，抑制脑卒中炎性反应。抑制miR-15a/16-1，增强缺血小鼠脑中claudin-5的mRNA和蛋白质表达，促炎性M1型巨噬细胞的浸润减少，小鼠脑梗死面积减小[14]。脑卒中早期注射miR-124，小鼠神经元存活率显着提高，M2型巨噬细胞数量显着增加，炎性反应被抑制[15]。这些结果揭示了miRNA作为脑卒中巨噬细胞M1/M2型的调节因子的作用，同时为脑卒中诊断提供了新的标志物。但miR-21a-5p作为炎性反应的重要调节因子，在脑卒中病理进程中的炎性反应的作用机制目前尚不明确[16,17]。

本研究拟通过合成miR-21a-5p mimics转染LPS处理的巨噬细胞，检测miR-21a-5p对LPS诱导的巨噬细胞损伤的影响，并对其作用的分子机制进行探讨，为脑卒中的诊断提供生物学标志物，为靶向药物的研发提供理论依据。

材料与方法

1.细胞培养与分组：小鼠RAW264.7巨噬细胞用含10% 胎牛血清(美国Gibco公司)，1%双抗的DMEM培养基(美国Gibico 公司)培养，放置在37℃、5%CO2的培养箱(日本Sanyo公司)中。通过LPS(美国 Sigma 公司)预孵育巨噬细胞 24h，促进巨噬细胞M1极化。细胞分组：不做任何处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞组为对照组；仅用LPS处理的RAW264.7巨噬细胞组为LPS处理组。

2.细胞转染：2μmol/L miR-21a-5p mimics或阴性对照miRNA-NC或5μl Lip2000(美国 Invitrogen公司)分别加入 OPTI-MEM(美国Gibco公司)稀释至250μl，混合静置15min后转染LPS(1μg/ml)处理的RAW264.7巨噬细胞。转染6h后换含10% 胎牛血清，1%双抗的DMEM培养基继续培养。

3.RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：当培养的细胞长到80%～90%密度时，Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取RNA，cDNA合成试剂盒(日本TaKaRa公司)获得cDNA，SYBR®PrimeScriptTMⅡ RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)进行定量检测。采用相对定量的比较Ct法，即2-△△Ct法检测miR-21a-5p和MATN2水平，以U6和GAPDH的表达作为内参。引物序列详见表1。

表1 引物序列

4.miR-21a-5p mimics和阴性对照miRNA-NC的合成并验证：根据小鼠miR-21a-5p序列，合成miR-21a-5p mimics及其阴性对照miRNA-NC，转染LPS(1μg/ml)处理的RAW264.7巨噬细胞，qRT-PCR检测miR-21a-5p水平。

5.MTT检测细胞活力：在96孔板中接种1×104按照一定实验处理的RAW264.7巨噬细胞，孵育24h后，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3遍，每孔加入500μg/ml MTT(美国 Sigma 公司)孵育4h，Elx-800酶联免疫仪(美国Bio-Tek公司)检测570nm处的吸光度，计算细胞活力改变。

6.流式细胞术检测细胞凋亡：AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测细胞凋亡，收集3×104个细胞，预冷的70%乙醇4℃固定2h。离心弃去固定液，3ml PBS重悬，清洗3次。1ml PI(碘化丙啶)染液染色，4℃避光30min。FACSAria Ⅱ流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)检测细胞凋亡比例，进行3次独立重复实验，统计细胞凋亡比例。

7.ELISA检测炎性细胞因子水平：LPS(1μg/ml)处理24h后，进行miR-21a-5p过表达处理48h，收集细胞蛋白，ELISA检测促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平(上海碧云天生物技术有限公司)。一抗37℃孵育2h；相应的HRP-二抗37℃孵育1.5h。OPD作为显色底物，37℃反应约10min。Elx-800酶联免疫仪读数，读数波长为490nm。

8.蛋白免疫印迹技术(Western blot法)：细胞收集后用RIPA缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)冰上裂解30min，BCA(美国 Hyclone 公司)测定蛋白含量，每孔加入40μg蛋白，10% SDS-PAGE 胶分离，转移到PVDF膜(美国Millipore 公司)，5%的脱脂牛奶室温下封闭1.5h，TBST洗脱3次，每次10min，用MATN2抗体孵育过夜，二抗1∶5000稀释室温下孵育2h。内参选用β-actin。

9.双荧光素酶报告实验：据TragetScan数据库预测的miR-21a-5p和MATN2 3′ UTR的结合序列合成MATN2野生型荧光报告质粒(MATN2-WT)和突变型荧光报告质粒(MATN2-MT)，分别与miRNA-NC或miR-21a-5p mimics共转染LPS(1μg/ml)处理的RAW264.7巨噬细胞 48h，荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega 公司)检测荧光素酶活性。

结 果

1.miR-21a-5p在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中水平降低：使用不同浓度的LPS(0、0.25、0.5、1、2μg/ml)诱导RAW264.7巨噬细胞，qRT-PCR检测miR-21a-5p水平。与对照组比较，随着LPS处理浓度的增加，miR-21a-5p水平逐渐降低。LPS处理浓度大于1μg/ml时，miR-21a-5p水平比较，差异无统计学意义(图1)。

图1 不同浓度LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中miR-21a-5p水平

2.miR-21a-5p mimics抑制LPS诱导的巨噬细胞损伤：miR-21a-5p mimics转染LPS(1μg/ml)处理的RAW264.7巨噬细胞后miR-21a-5p水平显著升高。上调LPS(1μg/ml)处理的巨噬细胞miR-21a-5p水平后，细胞活力显著升高，细胞凋亡比例降低；促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低(图2)。

图2 miR-21a-5p对LPS诱导的巨噬细胞的影响

3.MATN2是 miR-21a-5p直接靶基因：通过TargetScan数据库预测miR-21a-5p靶基因，发现MATN2是miR-21a-5p潜在靶基因(图3A)，双光素酶报告实验表明miR-21a-5p mimics特异性地降低MATN2-WT荧光素酶活性(图3B)，miR-21a-5p inhibitor促进MATN2蛋白表达和MATN2 mRNA水平(图3C)，miR-21a-5p mimics抑制MATN2蛋白表达和MATN2 mRNA水平(图3D)。结果表明MATN2是miR-21a-5p直接靶基因。

图3 miR-21a-5p靶向MATN2 mRNA的3′UTR

4.miR-21a-5p靶向MATN2抑制LPS诱导的巨噬细胞损伤：MATN2过表达质粒转染LPS(1μg/ml)诱导的RAW264.7巨噬细胞后，MATN2蛋白表达和MATN2 mRNA水平上调(图4A)；MTT结果表明MATN2过表达质粒转染LPS(1μg/ml)诱导的RAW264.7巨噬细胞后，细胞活力下降，在此基础上进一步转染miR-21a-5p mimics，细胞活力升高(图4B)；流式结果表明MATN2过表达质粒转染LPS(1μg/ml)诱导的RAW264.7巨噬细胞后，细胞凋亡比例升高，在此基础上进一步转染miR-21a-5p mimics，细胞凋亡比例下降(图4中C和D)。

图4 miR-21a-5p通过MATN2抑制LPS诱导的巨噬细胞损伤

讨 论

脑卒中是神经系统最常见的疾病之一，缺血性脑卒中是由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现，严重影响着患者的生存质量。研究发现，脑卒中发生后，浸润性巨噬细胞介导的神经炎性级联反应在调节缺血性脑损伤中发挥关键作用，M1型巨噬细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，加重中枢炎性反应；M2型巨噬细胞分泌抗炎性细胞因子IL-4、IL-10、IL-13 和TGF-β，发挥神经保护作用，抑制炎症，促进脑损伤修复[18～20]。小鼠模型研究发现脑卒中早期，M1型巨噬细胞数量增多，抑制脑卒中后的损伤修复，脑卒中恢复期M2型巨噬细胞增多，促进神经元功能恢复[21,22]。

miR-21a-5p作为炎性反应的重要调节因子，在慢性阻塞性肺疾病患者中miR-21a-5p水平降低，升高miR-21a-5p靶向抑制TNF-α-TLR4通路，减轻炎性反应[16]。笔者研究发现，在创伤性脑损伤中miR-21a-5p水平升高，miR-21a-5p同时影响NF-κB，Akt和Ang-1/Tie-2信号转导的活性抑制炎症和凋亡来减轻受损的脑微血管内皮屏障的渗漏[17]。本研究通过LPS处理巨噬细胞，促进巨噬细胞M1极化，发现使用不同浓度的LPS诱导RAW264.7巨噬细胞，随着LPS处理浓度的增加，miR-21a-5p水平逐渐降低。同时，上调LPS处理的巨噬细胞miR-21a-5p水平，细胞活力显著升高，细胞凋亡比例降低；促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低。

通过TargetScan数据库预测发现MATN2是miR-21a-5p潜在靶基因，双光素酶报告实验表明MATN2是 miR-21a-5p直接靶基因。动物实验研究发现细胞外基质蛋白matrilin-2(MATN2)能够通过TLR4/NF-κB接诱导巨噬细胞中促炎基因的表达，加重中枢神经系统炎性疾病[23]。另有研究者对过敏性鼻炎患者和健康人进行研究，发现抑制MATN2，能够促进巨噬细胞M2极化[24]。在LPS处理的RAW264.7巨噬细胞中，下调miR-21a-5p 表达可以促进MATN2蛋白表达和上调MATN2 mRNA水平，上调miR-21a-5p 表达抑制了MATN2蛋白表达和下调MATN2 mRNA水平。

综上所述，本研究发现miR-21a-5p在M1型巨噬细胞中表达降低，并且证实高表达的miR-21a-5p能够下调MATN2表达，抑制LPS诱导的巨噬细胞损伤，使得细胞活力显著升高，降低细胞凋亡比例和促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平。本研究首次明确miR-21a-5p/MATN2在巨噬细胞极化中的作用，进一步丰富了脑卒中炎性反应的病理、生理机制，为脑卒中诊断提供分子标志物，同时为脑卒中的靶向治疗提供新的策略，具有重大的科研和临床意义。