响应面法优化黄精 大枣果酒发酵工艺及其抗氧化活性

宋艺君，郭 涛，刘世军，吕慧锋，徐娜娜，叶 建，焦 慧，贺如梦

(1.陕西中医药大学药学院，陕西咸阳712046;2.空军第九八六医院药剂科，陕西西安710054;3.西安千禾药业股份有限公司 质量部，陕西西安710075)

黄精为百合科植物黄精Polygonatum sibiricum Red.、多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua或滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.的干燥根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳等［1］。黄精主要含有多糖、皂苷、多酚、黄酮等成分，另外还含有多种氨基酸和微量元素［2］，具有抗衰老、提高免疫力、降血糖、抗病原微生物等作用［3－4］。大枣来源于鼠李科植物枣(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果实［1］，具有补中益气，养血安神的作用，用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁等［1］。大枣富含糖类、粗纤维、维生素、氨基酸、矿物质等多种营养成分［5－7］，其中，多糖是大枣中具有重要生物功能的成分，营养保健价值很高［8－10］。现代药理研究发现黄精、大枣均有抗氧化活性，且配伍后抗氧化作用增强，同时黄精、大枣均为药食两用中药，近年来，随着保健、营养食品的发展，黄精、大枣开始逐渐用于食品制造［11－14］，如饮料、果丹皮等。

以果汁或新鲜水果为原料，经过破碎、榨汁，经部分或全部发酵酿制而成的酒，称为果酒。采用干果加水发酵保健果酒，发酵时间比较灵活，解决了原料的季节性问题，干果发酵避免了打浆的过程，对干果温浸后发酵即可，且干果不容易霉变，使原料的贮存更容易。果酒品质受到发酵工艺、物料质量及酵母用量等因素影响［15－18］，所以确定最优发酵工艺条件对酿造的果酒的质量至关重要。

本试验采用响应面试验设计，以酒精度和感官评分的总评归一值为评价指标，优化黄精－大枣果酒主发酵工艺，同时还采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)法，2，2－联氮－二(3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸)二铵盐(ABTS)法测定不同发酵时间黄精－大枣果酒的抗氧化活性。通过对黄精－大枣果酒发酵工艺和抗氧化活性的研究，可为黄精－大枣果酒的发酵提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄精 购自陕南;大枣 购自渭南市合阳县，由陕西中医药大学药学院王继涛教授分别鉴定为百合科植物黄精(Polygonatum sibiricum Red.)的干燥根茎，鼠李科植物枣(Zizyphus jujuba Mill.)的干燥成熟果实;XR干酵母 法国诺盟集团;果胶酶 法国LAFFORT公司;偏重亚硫酸钾 天津市科密欧化学试剂有限公司;ABTS、DPPH对照品 上海生物科技有限公司;白砂糖(食品级)人人乐超市;纯净水 咸阳涟漪有限公司;其余试剂 均为分析纯。

SPX－Ⅱ型生化培养箱 上海新苗医疗器械公司;APLI型手持折光仪 衡州艾普计量仪器公司;BT－25S型电子天平 北京赛多利斯仪器有限公司;UV2550型紫外可见分光光度计 岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄精大枣果酒发酵工艺流程 大枣+黄精→加水浸泡、煎煮→过滤→药液→酵母活化→成分调整→接种发酵→倒瓶→后发酵→澄清→灌装→杀菌→陈酿→成品

1.2.1.1 黄精的加工炮制 取黄精药材，按照2015版《中国药典》黄精饮片方法炮制［1］。

1.2.1.2 酵母活化 于XR干酵母中加入大约10倍量38～42℃水，在40℃恒温水浴锅活化0.5 h，每隔10 min搅拌一次［19－20］。

1.2.1.3 操作要点 大枣剔除枣核、切小块，黄精切片，将两种物料按不同配比组合，放入烧杯，并加入适量水浸泡30 min，煎煮(沸腾后文火30 min)，煎煮液用纱布过滤，滤液加入一定量酵母后在25℃静置发酵，发酵前3 d每天保持搅拌1次，发酵液无气泡后发酵基本完成。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 (黄精∶大枣)物料组分比对果酒发酵效果的影响 选取1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1(g/g)物料组分比，控制酵母用量0.5 g/L，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官评分为评价指标确定物料组分比。

1.2.2.2 液料比对果酒发酵效果的影响 选取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1(mL/g)液料比，控制(黄精∶大枣)物料组分比1∶1(g/g)，酵母用量0.5 g/L，以酒精度和感官评分为评价指标确定液料比。

1.2.2.3 酵母用量对果酒发酵效果的影响 选取0.1、0.3、0.5、0.7 g/L酵母用量，控制物料组分比(黄精∶大枣)1∶1(g/g)，液料比20∶1(mL/g)，以酒精度和感官评分为评价指标确定干酵母用量。

1.2.3 响应面优化试验 以单因素实验结果为基础，进行三因素三水平的响应面试验，确定黄精－大枣果酒最优的主发酵条件，试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 发酵指标的测定

1.2.4.1 感官评价 黄精－大枣果酒酒体淡黄色，醇香可口，具有黄精和大枣特有的香味，无异味，澄清。由10名专业人员组成的感官评定小组参照GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对黄精－大枣果酒从澄明度(25分)、色泽(25分)、滋味(25分)和香气(25分)4个方面进行感官评定，酒样总分为4项得分之和，满分为100分。感官评分标准见表2。

1.2.4.2 酒精度测定 按GB/T 15038－2006相关规定执行。

1.2.4.3 理化指标和微生物指标的测定 按GB/T 15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定的方法测定果酒中的总糖、总酸、干浸出物指标。按GB/T 4789.2、GB/T 4789.3、GB/T 4789.4、GB/T 4789.5、GB/T 4789.10规定的方法测定微生物指标。

表2 果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine

1.2.5 抗氧化活性试验 黄精－大枣果酒的抗氧化活性试验分为对DPPH﹑ABTS自由基的清除能力的测定，参考文献方法测定。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定 参考文献方法［21］。称取9.85 mg DPPH以无水乙醇定容至250 mL作为DPPH工作液，在反应体系中，于10 mL试管中加入200μL不同浓度的样品溶液，再加入2 mL DPPH工作液，振荡摇匀，于室温下避光静置30 min，测定517 nm处的吸光值，以加入等量的超纯水作为空白对照。以样品浓度为自变量，自由基清除率为因变量作图并进行线性拟合，计算IC50值，其中IC50值定义为清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度，所需浓度越低，表明该物质抗氧化性越强。

DPPH自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中:As为样品管的吸光值，A0为对照管的吸光值。

1.2.5.2 ABTS自由基清除能力的测定 参考文献方法［21］。称取0.1920 g ABTS，0.0331 g K2S2O8于烧杯中，并用去离子水定容至50 mL，使ABTS浓度为7 mmol/L，过硫酸钾的浓度为2.45 mmol/L，将该溶液于室温下暗处静置12～16 h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH7.4)稀释至734 nm处吸光值为0.70［22］。反应体系中，于10 mL试管中加入20μL不同浓度的样品，再加入2 mL ABTS反应液，振荡摇匀，室温下静置10 min，测定反应液在734 nm处的吸光值，以不加入样品的ABTS自由基溶液为空白对照，并计算IC50值。

ABTS自由基清除率(%)=(1－As/A0)×100

其中，As为样品管的吸光值，A0为对照管的吸光值。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据分析和作图，采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 物料组分比对主发酵效果的影响 由图1可知，当黄精所占比例相对较小时，随着其比例的逐步增加，果酒的感官评分也随之增高，但酒精度指标变化不明显;当黄精和大枣的比例达到3∶2(g/g)时，果酒的感官评分达峰值(93分);但当黄精比例继续增加时，酒精度和感官评分均出现下降的趋势。尽管黄精经发酵后产生的独特风味可克服原料少酿酒香气单一的缺点，但其所占比例增大后易使酒体出现较强的甜味。故当大枣、黄精两者比例适当时，可赋予果酒特殊的风味，因此选择物料组分比(黄精∶大枣)2∶3、1∶1和3∶2(g/g)用于后续响应面优化试验设计。

图1 物料组分比对主发酵的影响Fig.1 Effects of material composition ratio on main fermentation

2.1.2 液料比对主发酵效果的影响 由图2可知，液料比在15∶1～25∶1(mL/g)范围内变化时，果酒的评价指标(酒精度和感官评分)随着溶剂比例的增大而增高，感官评分最高为91分，对应的酒精度也达到最大，为8.02%vol;当液料比进一步增大，易出现酒精度偏低、风味不佳的现象。因此选择液料比20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)用于后续响应面优化试验设计。

图2 液料比对主发酵的影响Fig.2 Effects of water/material ratio on main fermentation

2.1.3 酵母用量对主发酵效果的影响 由图3可知，当酵母用量处于0.1～0.5 g/L时，随着其用量的逐步增加，果酒的评价指标(酒精度和感官评分)也随之增加。一般酵母用量过低时，物料发酵不完全，造成发酵液酒精度偏低及酒香不明显等现象。当酵母用量增加到0.5 g/L时，果酒的感官评分为90分;当酵母用量进一步增加时，酒精体积分数虽有增大，但易造成酒醅发酵过于快速、整个果酒酒体出现苦味的现象。故选择酵母用量为0.3、0.5、0.7 g/L用于后续响应面优化试验设计。

图3 干酵母用量对主发酵的影响Fig.3 Effects of dry yeast dosage on main fermentation

2.2 响应面优化发酵工艺

2.2.1 试验设计和结果 在单因素实验的基础上，选取物料组分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)为考察因素，以酒精度和感官评分的OD值(Y)为评价指标进行响应面试验设计。OD值计算步骤［23］:采用Hassan法对酒精度(d1)和感官评分(d2)指标进行归一化处理，di=(Mi－Mmin)/(Mmax－Mmin)。式中di为每一指标的OD值，Mi为指标测量值，Mmax和Mmin指每一指标在所有实验中的最大值和最小值。总评归一值(OD)=(d1+d2+d3+…dk)/k(k为指标数)。响应面试验设计方案和结果如表3所示。

2.2.2 模型拟合和显著性分析 采用Design－Expert 8.0.6软件，将表3中的指标成分(酒精度和感官评分)的OD值进行多元回归拟合和二项式分析，建立黄精－大枣果酒发酵工艺OD值(Y)对物料组分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)的二次回归模拟方 程Y=－5.02424+1.21322X1+0.36842X2+1.43136X3－0.084928X1X2+1.41747X1X3－0.15363X2X3

回归模型的方差分析结果见表4。由表4可知，在1次项中，X1为显著项(P＜0.05)，X2、X3为极显著项(P＜0.01)，P值分别为0.0151、0.0022、0.0002，显著程度X3﹥X2﹥X1，说明酵母用量对响应值的影响最大，液料比次之，物料组分比最小;2次项中，为显著项(P＜0.05)，说明液料比对响应值的影响是非线性的;交互项中，X1X2、X2X3为极显著项(P＜0.01)，X1X3为显著项(P＜0.05)，表明X1和X2、X2和X3之间交互作用极显著，X1和X3之间交互作用显著。

拟合模型的P值小于0.01，本模型极显著，失拟项的P值大于0.05，不显著;该回归模型的总决定系数R2=0.9294，调整决定系数，变异系数CV=5.08，以上参数均说明该模型拟合程度好，实验误差小，且模型的残差可能是由随机误差所产生。模型能够较好地反映物料组分比(X1)、液料比(X2)、酵母用量(X3)与酒精度和感官评分的OD值(Y)之间的变化关系，能够用来对黄精－大枣果酒发酵工艺进行分析和预测。

按所得模型绘制物料组分比、液料比和酵母用量的交互作用对黄精－大枣果酒主发酵工艺影响的3D响应面图如图4所示。响应面图是响应值对各影响因素所形成的三维空间曲面图，通过响应面图可形象看出最优取值点及各参数之间的相互作用［24］。由图4可直观看出各因素交互作用对果酒酒精度和感官评分的OD值的影响，如果曲线越陡，则表明该因素对果酒OD值的影响越大［25］。从图4可看出X3(酵母用量)对果酒OD值的影响最大，X2(液料比)次之，X1(物料组分比)最后，与表4方差分析的结果一致。根据试验分析结果，计算并预测二次回归方程，结果黄精－大枣果酒最优主发酵工艺为物料组分比(黄精∶大枣)2∶3(g∶g)，液料比29.71(mL∶g)，酵母用量0.35 g/L，OD值为0.9852。

表3 响应面试验设计和试验结果Table 3 Design and results of response surface

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

图4 X1、X2、X3交互作用的三维响应面图Fig.4 3D response surface of X1，X2，X3 for their mutual interaction

2.3 验证实验

根据最优工艺筛选结果，结合实际情况，将黄精－大枣果酒最优主发酵工艺调整为物料组分比2∶3(g/g)、液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L。根据各因素优选的结果进行3组平行验证试验，得到的黄精－大枣果酒的感官评分为(90.67±1.53)分，酒精度为9.23%±0.30%vol，测定结果稳定，偏差不大，说明该试验结果合理可靠。

2.4 理化指标

经测得黄精－大枣果酒在最优发酵工艺条件下的酒精度为9.2%vol，干浸出物32.8 g/L，总酸7.2 g/L(以酒石酸计)，总糖37.4 g/L(以葡萄糖计)，半甜型。均符合国家标准的要求。

2.5 微生物指标

大肠菌群≤3 MPN/100 mL，菌落总数≤50 CFU/mL，致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌):不得检出。均符合国家标准的要求。

2.6 黄精－大枣果酒发酵过程抗氧化活性的变化

2.6.1 黄精－大枣果酒发酵过程DPPH自由基清除率的变化 由图5可知，黄精－大枣果酒发酵过程对DPPH自由基的清除率基本处于高水平，最高值99.5%，说明黄精－大枣提取液和发酵液均具有较强的清除DPPH自由基能力。图5中DPPH自由基清除率先缓慢上升后缓慢下降，可能与发酵液中所含抗氧化成分多糖、多酚和黄酮的含量变化有关。0～72 h，DPPH自由基清除率升高，此阶段果酒发酵速度较快，由于黄精、大枣前处理时的浸泡、煎煮使所含多糖、黄酮和多酚等成分溶出从而使其含量升高，抗氧化活性提升。72 h后是发酵后期，DPPH自由基清除率慢慢下降，可能是由于发酵过程中多糖的转化，黄酮的不稳定性及多酚被分解，导致抗氧化活性降低［26－27］。

图5 发酵过程DPPH自由基清除率的变化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate during fermentation process

2.6.2 黄精－大枣果酒发酵过程ABTS自由基清除率的变化 由图6发现，ABTS与DPPH自由基清除率有相似的变化趋势，总体呈现先升高后降低趋势，72 h时最高值为92.0%。0～72 h，果酒发酵速度快，同样由于黄精、大枣的浸泡、煎煮使所含多糖、黄酮和多酚等成分溶出从而使其含量升高，ABTS自由基清除率升高。72 h后，发酵速率降低，酒精含量最高，多糖、黄酮和多酚等抗氧化成分含量降低，ABTS自由基清除率降低。发酵结束后黄精－大枣果酒的ABTS自由基清除率略高于黄精－大枣提取液。

图6 发酵过程ABTS自由基清除率的变化Fig.6 Changes of ABTSradical scavenging rate during fermentation process

3 结论

在单因素实验结果的基础上，对黄精－大枣果酒的主发酵工艺条件采用响应面法进行了优化，根据试验结果，影响果酒评价指标的因素按主次顺序依次为干酵母用量、液料比和物料组分比，最终确定黄精－大枣果酒最优主发酵工艺条件为:物料组分比2∶3(g/g)，液料比30∶1(mL/g)，酵母用量0.35 g/L;在此条件下得到的黄精－大枣果酒表现出均匀的淡黄色，酒香优雅，酒体协调，清澈透明，具有黄精和大枣典型风味;黄精－大枣果酒发酵过程中的DPPH清除率、ABTS清除率均呈现前期快速增长，后期逐渐下降的变化趋势，其最大值分别达到了99.5%、92.0 %。