SSR 分子标记两种电泳方法快速区分玉米种子杂交种

李巧英 郑戈文 任路路 张 华

（山西省农业种子总站 太原030006）

随着我国玉米产业的快速发展和育种技术的更新换代，玉米品种数量逐年增多，品种之间的关系错综复杂，遗传差异越来越小，传统的检测方法难以区分众多品种，使种子检测工作受到一定限制。 近年来分子标记技术不断发展， 基因水平检测已经广泛应用在种子检测方面。 SSR 分子标记方法试验重复性好、多态性高、周期短，可以快速准确地区分品种。 杨双[1]利用SSR 分子标记鉴定玉米品种沈玉21；郭奕生等[2]利用 SSR 分子标记鉴定玉米品种真实性。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，在一定电压作用下，将不同大小的核苷酸片段分离开，经过染色、显影、定影后，分析指纹图谱； 荧光毛细管电泳是通过毛细管将长短不一的核苷酸片段在高压电场中分离，通过软件分析数据，比较峰值图差异，可以实现多样品、多位点同时检测，工作效率大大提高[3]。 2020 年，笔者用SSR 分子标记方法区分10 个玉米杂交种， 从40 对SSR 引物中筛选出3 对多态性高的引物进行扩增， 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳方法进行分析。SSR分子标记法区分玉米种子杂交种，可操作性强、结果准确，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳适用范围广，荧光毛细管电泳品种区分能力强。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用10 份玉米杂交种及其标准样品，品种编号及名称，1：先玉 508；2：先锋 32D22；3：晋单73；4：宽诚 60；5：先玉 335；6：忻黄单 78；7：农华 101；8：晋单 55；9：农夫 9 号；10：咏丰 1 号。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 样品前处理，将玉米种子避光培养 3～4 d， 取植株幼叶 1～2 cm， 将 20～25 株样品混合加液氮充分研磨提取DNA， 或种子磨粉后取50～100 mg 试样，转入 2.0 mL 离心管进行提取。 DNA 提取可以用CTAB 法、SDS 法、 磁珠法或其他试剂盒方法，溶解后，用核酸蛋白分析仪检测其质量和浓度，稀释成工作液备用。

1.2.2 PCR 扩增 从 NY/T 1432－2014《玉米品种鉴定技术规程 SSR 标记法》[4]的40 对引物中筛选出3对多态性好、差异明显、峰型易识别的荧光标记引物umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2 进行扩增，引物序列及等位基因见附表。 PCR 反应体系和扩增程序参照NY/T 1432－2014《玉米品种鉴定技术规程 SSR 标记法》[4]。

附表 SSR 引物序列及等位基因

1.2.3 电泳检测

（1）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，将PCR 扩增产物变性，4.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，分析指纹图谱， 观察待测样品是否有标准样品所具有的独特标记， 确定待测样品与标准样品在该位点指纹是否一致。

（2）荧光毛细管电泳分析，将扩增产物根据标记荧光颜色及等位基因大小分组，用ABI 3500 基因分析仪分离PCR 产物，用SSR 指纹分析器分析不同品种在该位点的基因型， 检测结果与SSR 标准指纹数据库比对[5]，确定待测样品的品种信息。

2 结果与分析

2.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

用3对SSR引物umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2扩增10 个待测样品，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结果见图1。 由图1 可知，10 个待测样品和标准样品的指纹类型均一致， 由此可知待测样品和标准样品在这3 个位点无差异，结合其他引物检测结果，待测样品为该标注品种。 引物P24 共检测到3 个等位基因、4 种基因型，将10 个待测样品分成4 种类型。 引物P27 共检测到4 个等位基因、7 种基因型， 将在位点 P24 表现为同一基因型的待测样 1、2、4、10 分成3 种不同类型。 引物P37 共检测到4 个等位基因、5 种基因型，将P24 和P27 两个位点谱带一致的样品1、2、5、7 分成不同类型。 经 3 对引物组合扩增后，分析指纹图谱，将10 个不同的玉米杂交种品种准确地区分开。 且由图1 可知，这3 对引物扩增产物的电泳图谱主带明显，无非特异扩增，分离效果好，能够实现对目的条带的准确判读。 分析结果表明该引物组合多态性高、位点特异性强。

图1 引物P24、P27、P37 扩增10 个玉米品种变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图谱

2.2 荧光毛细管电泳检测

荧光引物 umc1536k9、bnlg490y4、umc2084w2 扩增10 个玉米种子杂交种， 毛细管电泳检测结果见图2。由图2 可知，引物P24 扩增10 份样品后共检测到4 个等位基因、6 种基因型， 叠加峰图上表现为4 个主峰，等位基因 222 bp 频率较高。 引物 P27 共检测到5 个等位基因、8 种基因型，等位基因271 bp 频率较高。 引物P37 共检测到6 个等位基因、8 种基因型，等位基因197 bp 频率较高。 检测结果与SSR 标准指纹数据库中同名样品指纹比对[6]，并将10 个玉米种子品种区分出。 分析图2 中3 对引物扩增产物的叠加峰图，主峰明显、无杂峰、峰型整齐，数据读取精确，避免了人为读数误差。 并且3 对引物等位变异范围 P24（212～241，无 214bp）、P27（265 ～332）、P37（177-214，无212 bp）没有重合，可以组合进行多重电泳分析，提高了工作效率，降低了试剂成本。

两种不同电泳检测平台数据结果会有一定偏差， 但都可以实现区分不同品种， 我们采用设置Marker 和参照样品、延长聚丙烯酰胺凝胶电泳时间、减小人员分析误差等方法来减少不同电泳检测平台间的偏差，实现数据整合。

3 结论与讨论

应用SSR 分子标记方法区分玉米种子杂交种，引物选择和电泳方法是关键，要选择区分能力强、多态性高的特异性标记， 优质的引物组合可以极大提高品种区分效率，降低检测成本。

图2 3 对引物扩增10 个玉米品种荧光毛细管电泳检测叠加峰

本研究中， 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光毛细管电泳，均可将10 个不同玉米品种区分开。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是通过两两样品比较分析，检测时需要将标准样品和待测样品的相邻泳道同时电泳或将待测样品与Maker 比较， 能比较SSR 指纹数据库中无标准样品的品种，数据精确度低，1～5 bp 差异不明显，因此，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比荧光毛细管电泳检测到的等位基因和基因型数目少。 荧光毛细管电泳只分离检测样品， 不需要标准样品的DNA， 但仅限于数据库中已包含标准样品指纹的品种检测，检测结果精确，可以将1 bp 的差异明显展示出来。 如P24 扩增的待测样品6 和8 均为双带，基因型为“233/238”和“232/238”，一条带相同，另一条带相差1 bp；P27 扩增的待测样品2 和样品5 基因型为“271/297”和“271/294”，第 2 条带相差 3 bp，图 1 中凝胶图谱差异均不明显， 图2 中荧光毛细管电泳可以清楚地观察到差异， 因此荧光毛细管电泳方法样品区分能力更强。

实验室可以根据试验要求、 仪器设备的配备情况、 标准样品及SSR 指纹数据库的配置选择电泳方法。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳适合区分差异较大的品种和小样本量研究应用，对仪器设备、试验条件要求较低，成本也低[7]；荧光毛细管电泳试验结果精确，能够清晰区分品种间差异较小的样本， 同时自动化程度高，降低了人为误差，可以实现样品高通量、位点高通量检测，工作效率更高，但成本也比较高。