HBsAg对干扰素基因刺激蛋白信号通路诱导外周血浆样树突状细胞生成干扰素α的影响

杜万威，耿 建，杨逸帆，王 霞，傅涓涓，潘修成

徐州医科大学附属医院 感染性疾病科，江苏 徐州 221002

在我国，HBV感染是慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌发生的主要病因[1-2]，其中机体抗HBV天然免疫和特异性免疫反应不足是HBV感染慢性化的关键原因[3]。浆样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是人体产生内源性Ⅰ型IFN的主要天然免疫细胞[4]，不仅直接发挥抗病毒作用，还能激活自然杀伤细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和髓样树突状细胞，从而诱导并增强抗病毒免疫应答[5]。既往研究[6-8]发现，HBV颗粒或HBsAg抑制pDC通过Toll样受体9(TLR9)通路表达IFNα，可能是HBV感染慢性化的重要原因。近期研究[9]发现，pDC中还存在不依赖TLR9的Ⅰ型IFN信号通路，即环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)-IFN基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes，STING)-Ⅰ型IFN信号通路。STING是调控Ⅰ型IFN基因表达的重要接头蛋白。细胞内游离的双链DNA在cGAS作用下，催化合成的环鸟甘酸-腺苷酸(cyclin GMP-AMP，cGAMP)直接激动STING 蛋白，然后通过TBK1介导干扰素调节因子3(IRF3)核转移进而诱导Ⅰ型IFN表达[10]。作为产生内源性Ⅰ型IFN的主要细胞，pDC可以摄取HBV颗粒、HBsAg等，并与其相互作用进一步影响pDC功能[4]。目前关于HBV感染和STING诱导的天然免疫应答通路之间关系的研究较少，HBsAg对pDC的STING-Ⅰ型IFN通路是否有抑制作用尚未见报道。本研究初步观察HBsAg对pDC通过激活STING通路表达Ⅰ型IFN功能的影响，以期进一步揭示HBV持续感染的发生机制，同时为慢性HBV感染免疫治疗方案的制订提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年2月—12月于徐州医学院附属医院感染性疾病科门诊及住院的慢性HBV感染者及体检的健康成人外周静脉全血。慢性HBV感染诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[11]。排除标准：(1)除外HCV、HDV或HIV重叠感染；(2)妊娠或哺乳期妇女；(3)合并酒精性肝炎、免疫性疾病；(4)伴其他严重疾病如恶性肿瘤，严重心、肺、肾、精神疾病，甲状腺功能亢进，糖尿病等。

1.2 材料 淋巴细胞分离液(Excellbio，中国)，IFNα ELISA试剂盒(Excellbio，中国)，IFNβ ELISA试剂盒(Excellbio，中国)，TNFα ELISA试剂盒(Excellbio，中国)，2′3′-cGAMP(Invitrogen, 法国)，FITC标记鼠抗人单克隆抗体(eBioscience，美国)，BDCA4树突状细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec, 德国)，磁珠分选套装(Miltenyi Biotec, 德国)。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血单个核细胞(PBMC) 分别采集慢性HBV感染者和健康成人外周静脉血，用淋巴细胞分离液以聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，培养基悬浮供后续实验取用。

1.3.2 PBMC培养 慢性HBV感染者与健康成人PBMC(2×106/ml)分别加入cGAMP(终浓度200 nmol/L)刺激16 h后留取上清-80 ℃保存。健康成人PBMC(2×106/ml)加入HBsAg(50 μg/ml)孵育24 h，然后加cGAMP(终浓度200 nmol/L)刺激16 h，同时设置对照组，留取培养上清-80 ℃保存。

1.3.3 磁珠分选 按前述方法获取健康成人PBMC(2×106/ml)以磷酸缓冲盐溶液(PBS)(100 μl)悬浮，分别加FCR-Blocking(100 μl)、抗-BDCA4(10 μl)后混匀、孵育、洗涤并离心后去上清，用PBS重悬后，按套装操作说明上机分选pDC。取分选后的PBMC即pDC - PBMC(1×106)体外以cGAMP按前述方法处理后收集上清供ELISA检测细胞因子，同时设置未去除PBMC作为对照组。

1.3.4 流式细胞术计数pDC 健康成人PBMC分别按前述方法予以HBsAg和cGAMP处理后，用100 μl的PBS悬浮并加入FITC标记鼠抗人单克隆抗体CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56各5 μl，再加入PE标记的CDl23和APC标记的CD303各10 μl，然后加FCR-Blocking 20 μl，室温避光孵育30 min。加入固定剂A 100 μl，固定15 min后离心(1500 r/min，5 min)弃上清，100 μl PBS悬浮并加固定剂A 100 μl，送流式细胞仪检测pDC细胞频数，APC-CD123和PE-BDCA2双阳性的细胞即为pDC。

1.3.5 ELISA检测细胞因子 根据ELISA试剂盒说明书分别检测研究对象血清IFNα、IFNβ和TNFα水平。检测细胞上清IFNα水平。

1.4 伦理学审查 本研究经由徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，批号：XYFY2020KL05201，入组患者均采取自愿原则，并签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入慢性HBV感染者43例，男27例，女16例，平均(32.43±8.60)岁；健康成人10例，男6例，女4例，平均(25.52±11.15)岁。2组研究对象在年龄、性别方面差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

2.2 慢性HBV感染者PBMC生成IFNα水平降低 与健康对照组相比，慢性HBV感染者的PBMC分泌IFNα水平明显降低，差异有统计学意义(t=4.868，P=0.001)。而2组间TNFα水平差异无统计学意义(P值>0.05)(表1)。此外，以cGAMP激活STING通路，在慢性HBV感染者或健康对照组PBMC培养上清中均未检测到IFNβ分泌。

表1 cGAMP刺激慢性HBV感染者和健康人群 PBMC细胞因子表达

2.3 HBsAg抑制cGAMP诱导健康成人PBMC分泌IFNα的能力 将HBsAg与健康人PBMC预先共孵育，然后以cGAMP刺激，采用ELISA检测培养上清IFNα水平。结果显示，cGAMP刺激可诱导健康人PBMC高水平分泌IFNα，而预先与HBsAg共培养过的PBMC分泌IFNα水平(448.5±52.0)相比，未培养组(571.0±30.8)明显降低(t=4.500，P=0.011)。

2.4 cGAMP诱导健康人PBMC中pDC生成IFNα 采用磁珠分选法去除健康人PBMC中的pDC，以cGAMP刺激16 h，ELISA法检测上清液中IFNα水平，并与未去除pDC的健康人PBMC比较，结果显示去除pDC组PBMC(pDC- PBMC组)培养上清IFNα水平(164.50±40.73)较未去除组(339.50±35.334)显著降低(t=6.482，P=0.001)。

2.5 HBsAg抑制cGAMP-STING通路激活后健康人PBMC中pDC频数 将健康成人PBMC预先与HBsAg共培养后并予cGAMP刺激，以流式细胞术分析pDC频数，结果显示cGAMP组外周血pDC细胞频数明显高于HBsAg+cGAMP组(P<0.05)(表2)。

表2 HBsAg对cGAMP刺激后的PBMC中pDC频数的影响

3 讨论

HBsAg是HBV的外膜蛋白，在HBV感染期间大量产生，并游离存在于慢性HBV感染者外周血循环。长期高载量HBsAg可导致抗HBV特异性T淋巴细胞耗竭以及干扰中和抗体结合[12]。不仅如此，HBsAg对机体抗HBV天然免疫反应也有抑制作用。近年研究[6]发现，HBsAg对pDC中TLR9通路诱导生成IFNα有抑制作用，可能是慢性HBV感染者外周pDC功能低下的重要原因。本研究结果显示，慢性HBV感染者外周pDC功能低下还与其STING通路诱导IFNα表达受到HBsAg抑制有关。

胞质中的游离DNA被DNA识别受体cGAS识别后，催化合成cGAMP以激活靶定在内质网上的STING蛋白，进而活化IRF3入核介导Ⅰ型IFN或活化NF-κB介导TNFα及IL-6等炎症因子表达[13-15]。本研究以cGAMP体外刺激PBMC，结果显示，慢性HBV感染者PBMC分泌IFNα能力明显低于正常对照组，而2组间TNFα分泌无明显差异，提示慢性HBV感染者PBMC中STING-IRF3-IFNα分泌通路受到影响，而TNFα表达量无明显改变。

慢性HBV感染者cGAMP诱导PBMC分泌IFNα水平低下可能与HBV颗粒、HBsAg或HBeAg等对其的抑制作用有关。已有研究[6]证实，HBsAg对pDC中TLR9诱导的IFN反应产生抑制作用，笔者推测HBsAg可能对cGAMP诱导PBMC的Ⅰ型IFN表达也有抑制作用。本研究以HBsAg预先与健康人PBMC共孵育，发现cGAMP诱导HBsAg预处理的健康人PBMC分泌IFNα的水平明显低于未经HBsAg预处理组，证实了笔者的推测，即HBsAg对cGAMP诱导PBMC通过STING通路表达IFNα能够发挥抑制作用。

pDC是机体产生内源性IFNα的主要细胞，是人体天然免疫应答的主要组成部分。有研究[5]报道，pDC受到HBV刺激后，分泌IFNα的能力是其他血细胞的100～1000倍。本研究也发现，将PBMC中pDC采用磁珠分选法去除后，再用cGAMP予以刺激，结果显示，去除pDC的PBMC分泌IFNα能力显著降低，证实pDC是PBMC中cGAMP激活STING通路产生IFNα的主要细胞。

为了进一步研究HBsAg对外周血pDC功能影响的机制，笔者用流式细胞仪检测pDC频数，结果发现cGAMP作用下的PBMC中pDC频数增加，而HBsAg预孵的PBMC在cGAMP作用下pDC频数明显下降。这可能是HBsAg抑制cGAMP诱导PBMC分泌IFNα的重要原因，具体机制笔者团队正在进一步研究中。

综上所述，HBsAg对cGAMP激活pDC中STING通路表达IFNα有抑制作用，这对进一步研究HBV持续感染的免疫发生机制及慢性HBV感染的免疫治疗方案的制订具有重要意义。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：杜万威、耿建、潘修成负责课题设计；杜万威、耿建负责实验操作，资料分析和撰写论文；杨逸帆、王霞、傅涓涓参与收集数据，修改论文；潘修成负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。