mTORC1基因通过下调YAP/TAZ信号通路抑制小儿肝母细胞瘤发展的机制研究

任 慧，陈秀珍，张 娟，牛会忠，耿建磊，赵天娇

(1. 河北省儿童医院，河北 石家庄 050000；2. 河北省优抚医院，河北 石家庄 050000)

肝母细胞瘤是一种胚胎性肿瘤，由肝细胞前体细胞产生并再现了肝脏发育的各个阶段，是儿童期最为常见的原发性肝脏恶性肿瘤[1]。近年来随着新辅助化疗、辅助化疗的应用及手术技术、肝移植技术的成熟，肝母细胞瘤患儿的5年总体存活率有了明显提高，但因为其发病机制及分子生物学机制尚未完全阐明，复发后的治疗及肝移植的相关治疗仍是肝母细胞瘤治疗的难点[2]。既往研究显示，CTNB1、CAPR2等基因突变导致的Wnt/β-catenin激活是诱导细胞增殖、存活、迁移和侵袭的重要途径和肝母细胞瘤发病的重要机制[3]。在小鼠模型中单独表达完整的β-catenin不足以引起肝母细胞瘤的发生，激活Yes相关蛋白(YAP)和β-catenin共同表达可导致实验动物体内肝母细胞瘤形成，提示YAP可能作为第二信使与β-catenin共同促进肝母细胞瘤的发生发展，但YAP促进肝母细胞瘤形成的分子机制尚未阐明[4]。哺乳动物雷帕霉素(RAPA)靶蛋白(mTOR)是非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导的信号通路对细胞的生长及生存具有重要调节作用，随着对mTOR研究的深入，发现其与衰老、肿瘤、糖尿病等疾病均存在相关性，YAP通路可激活mTOR信号通路，调控细胞生长，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[4]。本研究通过过表达人肝母细胞瘤HepG2细胞YAP/TAZ和RAPA抑制mTORC1共同探讨mTORC1在肝母细胞瘤发生、发展中的作用，为针对mTOR的靶向治疗提供理论和实验依据，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 人肝母细胞瘤细胞株HepG2购自中科院上海细胞生物所，细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度孵育箱培养，细胞经0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞进行培养。

1.2主要试剂与仪器 pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒、空白质粒由大连宝生物工程公司合成；RAPA购自武汉拉那白医药化工有限公司，纯度99%，货号：llb5458996；DMEM培养基和胎牛血清购自维森特生物技术(中国)有限公司；Xfecttm转染试剂、ABI7300荧光定量PCR仪、实时荧光PCR试剂盒购自赛默飞世尔；MTT购自上海源叶生物科技有限公司；Transwell小室购自上海子起生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1细胞分组与转染 收集对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后调节细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔板，细胞融合度达50%～80%时，分为空白试剂组、空白质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组，使用XfectTM转染试剂分别转染空白试剂、空白质粒、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒。

1.3.2实时荧光定量PCR法检测YAP和TAZ mRNA表达 按1.3.1方法转染后24 h，收集各组细胞，用RNAiso Plus提取细胞总RNA，检测RNA纯度和浓度，反转录成cDNA，反应体系为20 μL，用SYBR-PCR试剂盒检测YAP和TAZ mRNA水平，ABI7300荧光定量PCR仪溶解曲线采集，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列：YAP上游为5’-CAGCTTCTCTGCAGTTGGGA-3’，下游为5’-TCATGGCAAAACGAGGGTCA-3’；TAZ 上游为5’-TGGACCAAGTACATGAACCACC-3’,下游为5’-CTCCACAGCCGACTTGTTCT-3’；GAPDH 上游为5’-GGCTGCCCAGAACATCAT-3’，下游为5’-CGGACACATTGGGGGTAG-3’。

1.3.3MTT法检测HepG2细胞增殖活性 按1.3.1方法转染后12 h，空白试剂组、空白质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组采用正常培养基培养，pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组给予含100nmol/L的RAPA培养，分别在培养24h、48h、72h后每孔加入MTT10μL，37℃、5%CO2培养4 h，加入Formanzan溶解液100μL，摇床上低速振荡10 min，结晶物充分溶解后在酶标仪490 nm处测定吸光度。

1.3.4Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力按1.3.1方法转染后12 h，空白试剂组、空白质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组采用正常培养基培养，pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组给予含100 nmol/L的RAPA培养，培养24 h后，取各组细胞以3×104/孔密度接种于Traanswell小室中，将含5%FBS的培养基添加到Transwell小室下室，侵袭试验Tranwell小室预先涂基质胶，迁移试验Transwell小室不涂基质胶，将细胞置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养过夜，采用Diff Quik溶液染色，光镜下随机选取5个视野的侵袭、迁移细胞进行计数。

1.4统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计学数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组细胞中YAP/TAZ mRNA表达量比较 空白试剂组和空白质粒组YAP、TAZ mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组和pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组YAP、TAZ mRNA表达量均明显高于空白试剂组和空白质粒组(P均<0.05)，但pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组和pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组HepG2细胞中YAP/YAZ mRNA相对表达量比较

2.2各组HepG2细胞增殖活性比较 培养24 h、48 h、72 h后，pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组HepG2细胞增殖活性吸光度均明显高于空白试剂组、空白质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组(P均<0.05)，其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 各组HepG2细胞培养不同时间增殖活性吸光度比较

2.3各组HepG2细胞迁移和侵袭能力比较 pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组迁移细胞数和侵袭细胞数均明显多于空白试剂组、空白质粒组、pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组(P均<0.05)，其余组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组HepG2细胞迁移和侵袭能力比较个)

3 讨 论

儿童肝脏恶性肿瘤约占全身恶性肿瘤的1%，其中肝母细胞瘤约占儿童肝脏原发恶性肿瘤的80%，目前全球发病已从1.2/100万上升至1.5/100万，是儿童最常见的恶性肿瘤[4]。10%～20%的肝母细胞瘤患者易转移至肺、肝门、脑和骨，虽然标准化疗、手术技术取得了长足的进展，存活率有了明显提高，但总体预后仍不理想[5]。目前肝母细胞瘤尚无广泛公认的基因靶标和完善的分子分型[6]，其具体病因及发病机制尚不明确，其治疗手段仍有待完善。

肝母细胞瘤的发生、发展、转移涉及多个基因的变异，最常发生的基因变异位点位于Wnt信号通路[7]。近年来的研究显示，YAP是肝母细胞瘤发生的另一关键因素，在肝母细胞瘤患者中存在激活，β-catenin和YAP共同激活才能导致实验动物肝母细胞瘤产生，YAP或β连环蛋白沉默均可导致肝母细胞瘤增殖减少[8-9]，但YAP促进肝母细胞瘤发育的确切机制目前尚不明确。Hippo/YAP通路可与体内多个信号通路协同发挥作用，其可激活mTOR信号通路，mTOR通路是调节细胞生长和代谢的主要信号靶点，靶向mTOR途径是治疗多种肿瘤的有效方法[10-11]。Hartmann等[12]对24例肝母细胞瘤患儿的研究显示，96%的患儿血清中检测到p-mTOR表达。Tao等[13]及Li等[14]研究显示，73%～85%的肝母细胞瘤患儿YAP高表达，高于YAP在肝细胞肝癌中的阳性表达率，YAP和β-catenin共活化仅见于肝母细胞瘤，在原发性肝癌中未发现二者共激活。

本实验结果显示，人肝母细胞瘤细胞株HepG2转染pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒，过表达YAP/TAZ可增加YAP/TAZ mRNA表达，HepG2细胞YAP/TAZ途径被过度激活。对细胞增殖、迁移和侵袭能力的研究显示，pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组HepG2细胞增殖能力、迁移能力和侵袭能力均显著增强，提示增强YAP/TAZ信号通路可增加HepG2细胞增殖、侵袭和转移能力。RAPA是最早发现的mTOR抑制剂，可与FKBP12结合形成复合物，该复合物再和mTOR的FRB结构域结合，可特异性抑制mTORC1活性[15]。本实验结果显示，pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组和pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组YAP/TAZ mRNA表达量相近，但pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒+RAPA组HepG2细胞增殖、迁移和侵袭活性均低于pcDNA3.1-YAP/TAZ质粒组，因为RAPA的作用靶点为mTORC1，提示YAP/TAZ参与肝母细胞瘤发展的过程中需要mTORC1参与。

综上所述，激活mTORC1可能是YAP/TAZ信号通路参与肝母细胞瘤发生发展的重要途径，针对mTORC1的靶向治疗可能在肝母细胞瘤治疗中具有重要前景。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。