内蒙古地区蒙古族儿童MPO基因与川崎病相关性研究

肖 蓉 常 鑫 陈丽清

川崎病(Kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，病因尚不明确，亚洲地区多见，好发于5岁以下人群。病变较为严重的是CAL，且儿童时期发生的冠状动脉损害(CAL)可增加成年早期发生心肌缺血、冠状动脉粥样硬化的危险，因此KD所致CAL是目前临床治疗非常棘手的问题[1,2]。近年来，随着KD发生率的上升，国内外各地流行病学调查数据均发现，KD的发生、发展，尤其是合并CAL，与其遗传性及地区特异性有着较为密切的联系。在遗传性方面研究发现MPO基因不同位点基因多态性的表达对MPO酶活性有影响，其中MPO基因(-463G>A, rs2333227)的相关性较为显著[3]。因其具有地区特异性，熊志等[4]和赵宗秀等[5]进一步对大陆人群的MPO基因(-463G>A, rs2333227)展开研究，发现MPO基因的表达与KD易感性及KD并发CAL可能存在较为显著的相关性。通过以上研究分析，进一步验证了基因与KD易感性的显著相关性，而MPO基因(-463G>A, rs2333227)的发现，为KD并发CAL的病因方面提供了遗传分子学数据。近几年我国大陆内地对MPO基因与KD易感性及KD并发CAL的报道较为罕见，而探讨蒙古族KD儿童基因方面的病因与该基因更是缺乏。本项研究通过提取研究对象血标本中的MPO基因rs2333227位点，探讨在内蒙古地区的蒙古族KD儿童的该基因位点与KD易感性、KD并发CAL以及KD的典型临床特点的关联性，并为KD的病因学方面提供最新研究数据。

资料与方法

1.研究对象:选取2016年1月～2020年6月在内蒙古自治区儿童医院确诊的KD 100例蒙古族患儿为病例组。在相同时期选择100例在内蒙古自治区儿童医院儿保科健康体检的蒙古族儿童为对照组(均排除心、肺、肝、肾及血液系统疾病)。病例组通过心脏超声提示有无累及冠状动脉，将KD患儿归为CAL组，NCAL组。纳入标准：(1)KD患儿：①年龄6月～5岁蒙古族儿童；②符合美国心脏协会发表2017年修订的川崎病科学声明的典型KD患儿[6]；③排除猩红热、葡萄球菌烫伤样皮肤综合征、药物过敏等疾病。(2)对照组：①年龄 6个月～7岁蒙古族儿童；②经体检未发现异常的儿童，排除了各系统的疾病。本研究取得内蒙古自治区儿童医院医学伦理学委员会准许，并得到所有入组对象监护人的知情同意。所有入选对象均为祖籍三代居住在内蒙古地区、无血缘关系、无异族通婚史的蒙古族儿童。

2.方法：(1)收集KD患儿病初的临床资料，包括年龄、性别、典型KD症状，以及血常规、血小板、红细胞沉降率、N端脑钠肽结果。(2)对两组血液标本分别标记(病例组 A1-A50，对照组 D1-D50)，记录相关资料，使用华大基因公司试剂提取盒提取基因，并完成直接基因测序：上游引物为：5′-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3′，下游引物为：5′-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3′。PCR总反应体系50μl，含有10倍PCR反应缓冲液5μl，dNTP混合液4μl，引物各1μl，Ex公司 Taq酶0.25μl；测序反应体系为：2μl Mix(Bigdye3.1、5×sequencing buffer、H2O)，2μl纯化后的PCR 产物，1μl引物(5mmol/L)。

结 果

1.一般情况:100例病例组中，男性60例，女性40例，患者平均年龄1.80±1.26岁；对照组100例儿童中，男性54例，女性46例，平均年龄1.78±1.33岁，两组组间年龄和性别比例分布比较，差异无统计学意义(P均>0.05)；KD中有CAL组48例，男性28例，女性20例，平均年龄1.80±1.23岁；NCAL组中男性32例，女性20例，平均年龄为1.79±1.32岁。病例组、对照组两组在年龄、性别间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，CAL组、NCAL组两组在年龄、性别间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.PCR扩增产物的鉴定：MPO基因 rs2333227位点扩增产物的目标片段长度是665bp。以 Marker为参照标准，ddH2O为空白对照，图1PCR产物于600～700bp间的条带荧光度最适，且周围无其余非目的性条带存在，故提示该基因PCR扩增的产物浓度及纯度已达到目标。

图1 病例组与对照组MPO基因rs2333227位点基因型

3.MPO基因SNP位点基因型的确定及频率分布:病例组和对照组MPO基因rs2333227位点GG、GA和AA基因型频率分布比较，差异无统计学意义(χ2=2.392，P=0.302)，等位基因频率分布比较，差异无统计学意义(χ2=1.592，P=0.351)，详见表1。与GG基因型比较，GA和AA基因型与KD的发病风险无关(OR=0.64, 95%CI: 0.25～1.63，P=0.351)详见表2。

表1 病例组和对照组MPO基因的等位基因频率[n(%)]

表2 病例组和对照组MPO基因的相关性分析[n(%)]

4.CAL组和NCAL组MPO基因 rs2333227位点基因型及等位基因频率分布：KD中CAL组和NCAL组的MPO基因rs2333227位点GG、GA和AA基因型频率分布比较，差异有统计学意义(χ2=6.263，P=0.044)，等位基因频率分布比较，差异有统计学意义(χ2=4.037，P=0.045)，详见表3。与GA和AA基因型比较，GG基因型增加CAL的发生风险(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63，P=0.026)，详见表4。

表3 冠脉损害(CAL)组和非冠脉损害(NCAL)组的MPO基因等位基因频率[n(%)]

表4 KD中CAL组和NCAL组的MPO基因rs2333227位点的相关性分析[n(%)]

5.KD中基因多态性与临床特征的相关性:MPO基因rs2333227多态性与KD临床特征的相关性分析结果表明，皮疹、唇及口腔表现、手足症状、球结膜充血、淋巴结肿大、WBC、中性粒细胞百分比、红细胞沉降率、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表5。

表5 MPO基因多态性与KD临床特征的相关性分析

讨 论

KD以6个月～5岁患儿为多发年龄段，是一种急性全身性中小血管炎性疾病，约30% KD患儿在病程中尤其是急性期时可发现冠状动脉扩张，而冠状动脉瘤的形成及破裂是KD患儿死亡的最重要原因[7,8]。目前国内外研究表明，KD并发CAL的高危因素主要包括患儿年龄及性别、合并感染程度、较长时间持续的发热、实验室相关指标以及遗传基因等，故遗传因素的影响不容忽视[9,10]。MPO是过氧化物酶亚家族的成员，一种可以调控自身免疫及炎性反应的血红蛋白，对早期预警心血管疾病起着密切作用，是血管性炎症的重要生物学标志物之一，存在于胞质与膜相结合的天青颗粒中，由单核细胞、中性粒细胞等炎性和免疫细胞分泌，当机体受到刺激时，激活的炎性、免疫细胞迅速释放MPO，而MPO中的颗粒以脱颗粒形式或胞吐作用分泌到细胞外间隙中，催化过氧化氢与氯离子生成次氯酸，产生一系列的具有广泛生物学效应的活性氧，并导致氧化过激，导致免疫功能紊乱，损伤内皮细胞，其中冠状动脉的损伤较为多见[11]。因此MPO的任何异常表达和释放都可能加重炎症和组织的损伤[12～14]。有研究发现KD患儿的机体内存在过量氧化物，并可导致机体氧化应激，进而推测MPO基因与KD的发生可能存在关联性[15]。因此，MPO基因可能是KD发病过程中潜在的关键因素。

在MPO与KD的相关性方面，本研究对象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，且达到了遗传平衡，具有群体代表性，并在血液中均检测到MPO基因rs2333227 位点，存在GG、GA、AA型3种基因型，这与我国报道文献相同。经统计学分析得出，该基因的等位基因频率在病例组与对照组的分布中差异无统计学意义(χ2=1.592，P=0.351)，3种基因型的频率分布差异无统计学意义(χ2=2.392，P=0.302)，提示该基因位点与KD易感性无显著相关性，这与文献报道的结果有差异，考虑与种族、地域及遗传易感性相关，今后需进一步加大样本量开展深入研究[3～5]。

在MPO与KD临床特点方面，目前大多数医院对KD的诊断多以典型症状、实验室检测结果超声心动图结果为主要诊断方法。而在本研究中发现，KD典型临床表现(如皮疹、唇及口腔表现、手足症状、球结膜充血、淋巴结肿大)与MPO 基因 rs2333227 位点的各基因型无明显相关性，差异无统计学意义(P<0.05)，而熊志等[4]在该基因位点的研究中发现携带有GG基因型的患儿发生手足水肿、腹腔积液的比例较其他基因型患儿高，与本研究结果不同，考虑与样本量少及地区差异有关。

在实验室检查方面与KD关系密切且研究较多的是WBC、中性粒细胞百分比、红细胞沉降率、CRP及BNP，本研究中该基因位点与以上实验室检查结果无明显相关性，差异无统计学意义(P<0.05)；这与彭宇等[16]、张娟等[17]研究结果相同，且对于大部分KD患儿的WBC、血小板计数、CRP、BNP和红细胞沉降率是升高为主要表现。

在本研究中，MPO与KD并发CAL的研究结果是通过统计学分析得出MPO 基因 rs2333227 位点在CAL组和NCAL组中的3种基因型频率分布比较差异有统计学意义(χ2=6.263，P=0.044)，故认为该基因位点与KD并发CAL可能有相关性；在两组该基因位点的等位基因频率分布的研究方面，其分布比较差异有统计学意义(χ2=4.037，P=0.045)，还发现GG基因型增加KD并发CAL的发生风险(OR=5.13, 95%CI:1.22～21.63)，进而推测该基因位点G等位基因可能增加KD并发CAL的风险；这与以往研究结果相同，该研究中与G等位基因比较，携带A等位基因的患者对KD的保护作用增加了1.37倍(OR=0.73，95%CI:0.54～0.98，P=0.033)。本研究该基因位点中A等位基因频率在病例组、对照组中及CAL组及NCAL组中的分布比较差异无统计学意义，且国外报道推测MPO-463G>A(rs2333227)的A等位基因频率在不同种族存在一定不同，如在欧洲人群中为22.8%，在亚洲人群中约为14.7%，结合本研究对象均为内蒙古地区蒙古族儿童，且样本量不足，故对此结果仍须进一步完善及研究[18～20]。

目前已有多种基因被研究者发现与KD的易感性及并发CAL呈相关性，但关于单一致病基因对疾病发生影响的相关研究较少，结合此次研究样本例数少，实验条件较为局限性，各种与氧化应激有关的生物学标志物和中性粒细胞活化也未得到评估，且KD本身存在地区差异，MPO基因SNP rs2333227位点与KD的发生及KD并发CALs的确切关系尚需开展大样本量、多中心的研究予以证实。