结直肠癌MMR蛋白和MSI检测对比及临床病理特征分析

孙林雍 王紫静 唐 源 陈 昶 江 丹

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来 CRC发生率及病死率呈逐年上升趋势[1]。科学、规范的治疗对患者的预后至关重要，分子检测结果对临床制订治疗方案非常重要。各类指南均推荐应用免疫组化(IHC)法检测MMR蛋白表达及PCR法检测MSI位点。错配修复蛋白表达缺失(dMMR)和高度微卫星不稳定(MSI-H)对CRC患者的预后判断、药物疗效预测和Lynch综合征筛查有明确的指导意义[2，3]。Ⅱ期CRC患者如有MSI-H提示预后较好，但可能无法从氟尿嘧啶类单药辅助治疗中获益[4]。dMMR或MSI-H分子表型转移性结直肠癌的患者能从免疫治疗中获益[5]。因此，MSI检测或MMR状态是CRC目前最佳的疗效预测指标。IHC法具有操作简单、快捷、经济的特点，还可以对活检小标本进行检测，但IHC染色结果受组织固定、预处理、抗体克隆号不同等多种因素的影响。用PCR法检测肿瘤MSI状态，有研究者提出了一组5个单核苷酸重复序列BAT25、BAT26、NR21、NR24、NR22或NR27，具有较高的敏感度和特异性。这5个位点包含在本实验检测的6个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和MONO-27)中，有证据显示增加单核苷酸标志物可以提高MSI检测敏感度、特异性[6]。本实验旨在探讨CRC中MMR/MSI的发生状况与临床病理特征的相关性，以及指导个体化治疗中的作用，为临床病理诊断及预后评价提供更为完善的参考价值。

资料与方法

1.一般资料：收集2012年1月～2019年5月笔者医院诊断为CRC并已行MSI检测患者样本392例作为研究对象，其中，男性236例，女性156例。患者年龄16～85岁，中位年龄48.0岁。左半结肠138例、右半结肠122例、直肠132例。所有患者临床病理资料完整，均经手术治疗，有明确的病理诊断结果，选取样本中肿瘤占比>50%的蜡块和癌旁正常组织蜡块。

2.仪器与试剂：ABI 3730xl型遗传分析仪、Nanodrop2000微量核酸测定仪、LEICA BOND-MAX(徕卡全自动IHC染色仪)。石蜡包埋组织(FFPE)样本DNA提取试剂盒(56404，美国Qiagen公司)、MSI试剂盒(中国阅微基因公司)、一抗MLH1单克隆抗体(1∶50，克隆号：ES05)、MSH2单克隆抗体(1∶50，克隆号：RED2)、MSH6单克隆抗体(1∶50，克隆号：EP49)、PMS2单克隆抗体(1∶50，克隆号：EP51)均购自北京中杉金桥生物公司。第二抗体购自LEICA公司全自动IHC染色仪配套试剂盒。

3.DNA提取：将FFPE切成4μm厚薄片，取3～5张装入EP管中用于DNA的提取。按照QIAamp(Cat.56404)DNA FFPE Tissue Kit(50T)试剂盒说明书进行。使用Nanodrop2000测定DNA浓度，A260/A280为1.8～2.0。

4.IHC及结果判读：选取FFPE切取4μm厚的白片，65℃，烤片1h。直接使用LEICA BOND-MAX全自动IHC染色仪(徕卡公司)，染色程序参照厂家试剂盒说明书进行。4种抗体均为核着色，以淋巴细胞作为阳性内对照，肿瘤细胞核着色判读为阳性，无着色判读为阴性(图1)。4种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2)中至少1种蛋白缺失判定为dMMR；全部阳性判定为错配修复蛋白完整(pMMR)。

图1 错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2在结直肠癌中的表达(EnVision，×40)

5.MSI检测及结果判读：分别对肿瘤组织及癌旁正常组织进行DNA提取，取适量DNA在ABI 3730xl型遗传分析仪上，运用多重荧光PCR-毛细管电泳技术，采用MSI试剂盒对6个单核苷酸重复位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27和MONO-27)和Penta C、PentaD和Amelogenin位点进行检测。并且利用GeneMapper v3.2对检测数据进行分析。至少2个单核苷酸重复位点发生改变，归纳为MSI-H(图2)。仅有1个单核苷酸重复位点发生改变，归纳为低度MSI(MSI-L)。未发生改变，归纳为微卫星稳定(MSS)。

图2 PCR法检测MSI表型显示MSI-H

6.统计学方法：采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，定性资料的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法进行显著性检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.MSI检测及与临床病理相关性：392例CRC中，71例为MSI-H，4例为MSI-L，317例为MSS。MSI-H组与MSS/MSI-L组比较，在发病年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、组织学类型、临床分期及淋巴结转移等方面差异有统计学意义(P<0.05)；在患者性别、分化程度、浸润深度等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

2.MMR蛋白检测及与临床病理相关性：392例CRC IHC染色病例中，dMMR组74例，缺失率为18.9%；pMMR组318例，阳性率为81.1%。dMMR组与pMMR组比较，在发病年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、组织学类型、临床分期及淋巴结转移等方面差异有统计学意义(P<0.05)，在患者性别、分化程度、浸润深度等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)。MLH1、MSH2、MSH6及PMS2蛋白的表达情况详见表2。

表1 MMR/MSI与结直肠癌临床病理特征的关系[n(%)]

表2 MMR蛋白在结直肠癌中的表达

3.IHC与PCR法检测结果分析：392例CRC病例中，以PCR检测结果为标准，IHC的敏感度和特异性分别为97.2%和98.4%，以IHC检测结果为标准，PCR检测结果的敏感度和特异性分别为93.2%和99.4%，IHC检测MMR蛋白与PCR法检测MSI一致性为98.2%(表3)。

表3 IHC法检测MMR蛋白与PCR检测MSI一致性分析(n)

4.检测结果不一致病例分析：7例检测不一致的样本中，4例为男性，3例为女性；左半结肠5例，右半结肠2例；4例为腺癌，3例为黏液腺癌；2例PCR法检测结果为MSI-H，IHC法检测结果为pMMR；5例PCR法检测结果为MSS，IHC法检测结果为dMMR(表4)。

表4 IHC检测MMR蛋白与PCR检测MSI结果不一致情况(n)

讨 论

本研究中dMMR为18.9%(74/392)，MSI-H占18.1%(71/392)。李惠等[7]研究显示dMMR为14.7%。一项研究显示西方国家dMMR可达15%～20%，与本实验一致[8]。笔者医院地处西南，患者多来自多民族聚集区，dMMR可能与种族有关。文献报道MSI检出率为15%～19%，本组实验结果与文献基本一致，但低于刘超等[9]的研究，分析原因主要为纳入研究的病例临床分期不同导致的，刘超等[9]仅选择Ⅱ期和Ⅳ期结肠癌患者，而本组选取病例为Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌患者。

本实验中MLH1、MSH2、PMS2和MSH6的缺失率分别为12.5%、3.1%、15.1%和3.8%，即MLH1及PMS2缺失最为常见，与多数研究结果一致[10,11]。本实验结果显示，在342例MLH1阳性病例中，PMS2阳性332例；49例MLH1缺失病例中，PMS2缺失49例，380例MSH2阳性病例中，MSH6阳性376例；12例MSH2缺失病例中，MSH6缺失12例，说明MLH1与PMS2、MSH2与MSH6常协同表达或缺失，与多数研究结果一致[11,12]。MSH6和PMS2单独缺失分别为4例和10例。一般情况下MLH1蛋白的表达缺失同时伴有PMS2蛋白的表达缺失；MSH2蛋白的表达缺失同时伴有MSH6蛋白的表达缺失。PMS2或MSH6蛋白表达缺失可能不会导致MLH1和MSH2蛋白表达缺失。这种机制对本实验结果也是一种很好的解释。然而本实验中检测到1例MLH1与MSH6同时缺失的病例，重新阅片后发现MLH1切片内对照阳性很弱，重复检测后判读为pMMR。Mangold等[13]报道MSI肿瘤可表现为肿瘤细胞核表达明显弱于内对照细胞，或IHC染色存在异质性，说明有经验的病理医生在评估MMR蛋白与技术质量控制在结果判读中的重要性。

对比IHC法检测MMR蛋白与PCR法检测MSI的结果及其临床病理相关性，本实验显示两者的敏感度与特异性均在93%以上，一致性高达98.2%。IHC的敏感度高于PCR法，相反PCR法的特异性高于IHC。与大多数报道的结果一致[14,15]。说明检测MMR蛋白表达情况可有效地反映肿瘤MSI状态。Shia等[16]比较活检小组织与手术切除组织IHC染色结果显示两者具有高度的一致性，提示IHC法检测活检小组织MMR蛋白对预测肿瘤MSI状态具有一定的参考价值。

7例检测不一致的样本中，2例PCR法检测结果为MSI-H，IHC法检测结果为pMMR。Carethers等[17]也有类似报道。主要MMR蛋白包含MLH1、MSH2、PMS2、MSH6及PMS1，分析原因可能存在PMS1或其他未知蛋白表达缺失而导致MSI-H。因此，当PCR法检测结果为MSI-H，IHC法检测结果为pMMR时建议以PCR法检测结果为准。5例PCR法检测结果为MSS，IHC法检测结果为dMMR,其中2例MSH6蛋白单独缺失。有报道MSH6单独缺失时由于其功能冗余，PCR检测可能表现为MSS[18]；3例肿瘤含黏液腺癌，Muller等[19]提出黏液腺癌建议用显微切割技术选择癌细胞丰富区做PCR检测，可能与送检组织含黏液腺癌肿瘤实际占比<50%有关。

本研究结果显示，CRC中dMMR/MSI-H患者具有发病年龄早、肿瘤直径常≥5cm、好发于右半结肠、组织学类型以黏液腺癌多见、临床分期多发生于Ⅱ期、淋巴结未转移多见，与大多数研究结果基本一致。Kawakami等[20]研究显示，CRC中dMMR/MSI-H患者与分化程度有关，Raut等[21]研究发现MSI肿瘤多为女性。本实验结果显示，CRC中dMMR/MSI-H患者与性别和分化程度无关，分析原因可能与研究人群的种族分布以及样本数量有关。

综上所述，尽管两种检测方法具有较高的一致性，但均存在漏检的可能，因此有条件的医院可以用两种方法同时进行检测。MLH1与PMS2、MSH2与MSH6常协同表达或缺失。