烟曲霉菌损伤鼻上皮功能致慢性鼻窦炎的研究

张欠欠 张 玲 李志鹏 唐 如 张维天 叶海波

慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是一种病程超过12周的鼻窦黏膜慢性炎症性疾病[1]。在中国，其发生率高达8%。主要表现为鼻塞、黏脓性鼻涕、头面部胀痛及嗅觉减退或丧失。CRS是一种高度异质性疾病，病因复杂，目前主要归为3类，即上皮屏障功能受损、病原菌侵袭作用及宿主免疫系统的失衡[2]。鼻黏膜上皮作为病原体入侵鼻腔的第一道防线，在先天免疫和适应性免疫中都起着至关重要的作用，对维持鼻腔和鼻窦的健康具有重要意义。上皮屏障功能的维持主要依靠纤毛柱状上皮细胞的清除、分泌功能及各种胞间连接，如紧密连接(tight junctions)、黏附连接(adherent junction)、桥粒(desmosome)、缝隙链接(gap junction)及连接黏附分子(junctional adhesion molecules)等[3]。其中紧密连接蛋白位于胞间连接蛋白的最顶端，充当“守门员”角色阻止外来抗原入侵。一旦紧密连接蛋白遭到破坏，体外的微生物、过敏原及毒素等可以跨越上皮细胞侵入黏膜下层，导致疾病发生。研究表明，CRS、过敏性鼻炎、哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等发病均与上皮屏障功能受损有关[4,5]。

真菌是CRS的致病因素之一，鼻窦炎患者窦腔坏死组织中常有真菌存在，如曲霉菌、毛霉菌、链格孢属真菌及申克孢子丝菌等，其中以烟曲霉菌最为常见，与CRS的发病息息相关[6]。烟曲霉菌是一种植物腐生性真菌，广泛分布于空气、土壤及腐败植物中，通常不在人类呼吸道定植[7]。免疫功能受损的个体一旦感染烟曲霉菌，其细胞壁某些成分可以促使炎性粒细胞迁徙至感染病灶，引发炎性反应[8]。据此，本研究使用烟曲霉菌提取物建立慢性鼻窦炎的小鼠模型，并推测烟曲霉菌可能通过破坏上皮屏障功能致鼻窦炎症改变。

材料与方法

1.研究对象:20只小鼠随机分为两组，每组10只。对照组腹腔注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)与明矾的混合液200μl，鼻窦炎组等量腹腔注射烟曲霉菌提取物与明矾混合液以致敏。1周后，对照组每只小鼠每侧鼻孔每次滴入无菌PBS 10μl，3次/周，持续1个月；鼻窦炎组每只小鼠等量滴入20000PNU/ml 烟曲霉菌提取液，3次/周，持续1个月。

2.组织病理学研究:所有实验小鼠于第6周处死，按文献[9]中方法，于T2及T3层面取小鼠鼻窦组织脱钙及固定2周。石蜡切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)评估组织炎性反应状态、阿利新蓝-过碘酸雪夫(alcian blue and periodic acid-schiff staining，AB-PAS)染色评估杯状细胞变化、甲苯胺蓝(toluidine blue dyeing，TB)染色评估肥大细胞改变。

3.紧密连接蛋白的免疫组化评估：免疫组化染色(immunohistochemistry，IHC)评估烟曲霉菌提取物对小鼠鼻上皮紧密连接蛋白，如occludin、claudin-1及ZO-1表达的影响。

结 果

1.慢性鼻窦炎小鼠模型的建立：(1)HE染色：无论是在鼻底、鼻中隔及筛窦等鼻腔呼吸区或嗅区的黏膜部位，鼻窦炎组与对照组比较，可见纤毛柱状上皮结构紊乱呈波浪状改变，杯状细胞增生，黏膜下组织肿胀，伴有炎性粒细胞浸润和腺体增殖(图1)。此外，在鼻窦炎组小鼠鼻窦组织中观察到类似“息肉前改变”的上皮突起，在鼻腔中观察到类似“夏科-雷登结晶(charcot leyden crystals)”样分泌物(图2)。(2)AB-PAS染色：鼻窦炎组窦腔黏液分泌较对照组明显增多。杯状细胞未见显著增生；鼻窦炎组支气管上皮细胞AB-PAS染色结果显示杯状细胞明显增生(图3)。(3)TB染色：鼻窦炎组肥大细胞数量较对照组明显增加(图4)。

图1 小鼠鼻窦组织HE染色结果(×40)

图2 鼻窦炎组小鼠窦腔炎症改变

图3 小鼠鼻上皮及支气管上皮AB-PAS染色(×40)

图4 小鼠鼻上皮TB染色(×40)

2.烟曲霉菌提取物破坏鼻黏膜上皮紧密连接蛋白：IHC染色结果显示，紧密连接蛋白如occludin、claudin-1及ZO-1在鼻窦炎组小鼠鼻上皮表达量显著下降(图5)。

图5 小鼠鼻上皮紧密连接蛋白IHC染色(×200)

讨 论

本研究通过腹腔致敏及鼻腔滴注烟曲霉菌提取物的方法成功建立了小鼠CRS模型。组织病理学结果显示，CRS小鼠鼻腔黏膜增生肥厚，伴有上皮细胞形态改变(细胞排列无序、纤毛柱状上皮大小形态改变、杯状细胞增生、腺体增殖等)及黏膜下炎性细胞的浸润。此外，还观察到CRS小鼠鼻腔黏膜上皮紧密连接蛋白表达减少，这可能是烟曲霉菌提取物通过损伤鼻上皮屏障功能导致CRS发生的原因之一，“夏科-雷登结晶”样分泌物和类似“息肉前改变”的上皮突起提示烟曲霉菌可能进一步诱导了鼻息肉。

CRS模型动物有羊、兔、大鼠及小鼠等，其中小鼠由于操作简单，易于获得基因敲除表型等而获得广泛应用。但目前尚无成熟稳定的CRS模型，对小鼠模型成功的标准也尚未统一，这可能与CRS的不同分型及不同品种小鼠的遗传背景不同等相关。有关兔CRS模型成功的判断标准较统一，即鼻窦黏膜增生肥厚伴有大量炎性细胞浸润[10, 11]。参照兔CRS模型成功的标准，笔者的模型里出现了鼻窦黏膜增生肥厚、黏膜下腺体增生、上皮细胞形态改变及中性粒细胞浸润等较明显的系列鼻窦炎症改变，与临床上CRS患者的组织改变较一致。

Lindsay等[12]于2006年采用腹腔致敏及鼻腔滴注烟曲霉菌菌丝提取物的方式，建立了CRS的小鼠模型。由于本研究所使用的烟曲霉菌提取物成分和剂量与Lindsay等[12]不同，因此也有一些不同的研究发现,在鼻窦炎组小鼠上皮细胞层检测到了明显的肥大细胞增生，但并未观察到明显的嗜酸性粒细胞浸润。此外，可见纤毛柱状上皮结构紊乱呈波浪状改变，杯状细胞增生，黏膜下组织肿胀，伴有炎性粒细胞浸润(中性粒细胞为主)和腺体增殖。既往文献报道表明，烟曲霉菌细胞壁的蛋白质成分可促进中性粒细胞趋化至真菌感染部位，而细胞壁的壳多糖则与嗜酸性粒细胞的趋化及机体的2型炎性反应有关[8, 13]。而本研究选择的烟曲霉菌提取物中含量更多的是真菌细胞壁蛋白质成分，仅有少量的壳多糖，因此本研究的组织切片中并未见到明显的嗜酸性粒细胞浸润。当然这也可能与小鼠鼻腔正常定植菌群与造模用真菌的混合感染或是笔者选择的组织切片部位较局限有关。

本研究在鼻窦炎组小鼠支气管上皮层检测到了明显的杯状细胞增生，但在鼻腔上皮层只检测到了黏液分泌的增加，未见杯状细胞显著性改变。这可能是因为烟曲霉菌提取物破坏了杯状细胞并促进黏膜下腺体的增生，但具体原因尚不明确。另外，造模时出现下呼吸道感染这一点与人类鼻窦炎不同，但与人类比较，小鼠的呼吸道更短，造模时很难避免下呼吸道的炎性反应。本研究在小鼠鼻腔上皮检测到了“息肉前改变”的黏膜突起或囊泡样小体，文献提示这可能是CRS的息肉样变[12, 14]。由于本研究造模时间较短，所以并未见到真正的的“息肉样变”，延长烟曲霉菌作用时间或增加药物浓度或许可以见到较明显的改变。在小鼠鼻腔鼻窦中发现了类似于“夏科-雷登结晶”的分泌物，这提示鼻上皮下有嗜酸性粒细胞的浸润及Th2型炎性反应[15]。六胺银真菌染色结果并未见到两组有明显区别，这可能是因为烟曲霉菌提取物的刺激时间或剂量没有达到足以检测的水平。综合以上这些变化，小鼠鼻窦炎症改变明显，为后续研究奠定了基础。

Ahn等[16]通过手术干预、鼻腔填塞及滴注链球菌的方法，致鼻窦黏膜中性粒细胞浸润、上皮增厚、杯状细胞增生、黏膜下纤维增生及上皮结构紊乱等改变，建立了CRS模型。但手术干预直接损伤鼻窦的的方式并不符合人类CRS的发病过程。本研究采用腹腔致敏及鼻腔滴注烟曲霉菌的方式建立了CRS的小鼠模型更好地模拟了人类变应性真菌性鼻窦炎的发生、发展过程。紧密连接蛋白的免疫组化染色结果显示，与对照组比较，鼻窦炎组紧密连接蛋白如occludin、claudin-1、ZO-1等明显减少。真菌在鼻窦炎发病过程中的作用至今尚不十分明确，既往研究认为Th2型鼻窦炎性反应是真菌侵袭的结果，但随后许多研究并不支持这一观点[17]。

本研究结果表明，烟曲霉菌提取物可能通过破坏上皮屏障功能致鼻窦系列炎性反应。既往研究并未发现烟曲霉菌对鼻上皮紧密连接蛋白的破坏作用，且对烟曲霉菌致鼻窦炎的机制目前尚不明确，所以本研究对于探讨烟曲霉菌的致病作用具有重要意义。需要注意的是，上皮屏障功能的破坏涉及多个复杂机制，与上皮间质转化密不可分。临床研究证实，鼻腔鼻窦黏膜改变的气道上皮重塑是CRS特征之一[18]。研究表明，上皮间质转化的上皮细胞胞内骨架蛋白的结构改变使上皮细胞失去极性，胞间连接蛋白减少及波形蛋白产生增加[19]。表达波形蛋白的鼻上皮细胞可能与黏膜增厚及嗜酸性粒细胞浸润相关。因此，烟曲霉菌提取物与上皮间质转化的关系，以及烟曲霉菌提取物对上皮细胞形态和胞间连接蛋白等的影响有待未来进一步探究。

尽管本研究建立了慢性鼻窦炎的小鼠模型，但由于小鼠鼻腔鼻窦解剖与人类有较大不同，如不具有蝶窦及额窦的结构、鼻腔由大面积的嗅上皮覆盖及鼻甲结构比人类复杂等使得模型不能很好地模拟人类鼻窦炎的发生、发展[20]。其次，尚且缺乏对烟曲霉菌致鼻上皮紧密连接蛋白减少的机制研究，尚不明确紧密连接蛋白表达上调对CRS疾病缓解的作用。后续需通过增加体外细胞实验及分子生物学实验才可以对该现象及假设进行进一步验证。

综上所述，本研究通过建立CRS的BALB/c小鼠模型，阐述了鼻上皮间紧密连接蛋白的破坏在烟曲霉菌提取物致小鼠鼻窦炎发生中的作用。但分子作用机制目前尚不十分明确，仍需增加体外实验进行深入探讨。