线粒体氧化应激相关蛋白酶PRDX3在主动脉夹层中的表达及其意义

郑思豪 王志维

主动脉夹层(aortic dissection,AD)是一种极其凶险的大血管疾病，起病急骤，病死率高[1]。典型的AD表现为主动脉内膜撕裂，血液由破口涌入中膜内，主动脉中膜沿长轴分离，形成假腔。AD主要病理改变为主动脉中层退行性变(aortic media degeneration，AMD)，AMD的特征是主动脉中层血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的损失、细胞外基质紊乱、弹性纤维断裂以及蛋白聚糖和葡糖胺聚糖的聚集。其组织学特征包括慢性外膜和中膜炎性细胞浸润、弹性蛋白断裂和变性以及由跨壁血管炎症、细胞外基质降解和血管平滑肌细胞(VSMC)内环境平衡失调构成的中膜衰减[2]。

现有研究显示，线粒体氧化应激对调控细胞凋亡、细胞自噬、氧化应激等具有极其重要的作用,其在肿瘤、心力衰竭、扩张型心肌病、心肌梗死后的缺血再灌注损伤等中均发挥重要作用[3]。但是线粒体氧化应激与AD发生、发展的关系及其在主动脉平滑肌(VSMCs)凋亡中的作用联系尚未有具体的研究。本研究通过分析线粒体氧化应激相关蛋白-过氧化还原酶3(PRDX3)在AD患者和AD大鼠模型主动脉组织中的表达差异情况，研究其在主动脉夹层发生过程中的作用，旨在为主动脉夹层诊疗提供新靶点。

材料与方法

1.标本与实验分组:选取2018年8月～2019年4月于武汉大学人民医院确诊为StanfordⅠ型夹层并行胸主动脉全弓置换患者14例为AD组(n=14)，患者均经过CTA检查确诊为胸主动脉夹层，三维重建的结果显示破口位于升主动脉。所有患者术前均无冠心病、外周血管疾病、糖尿病、关节炎、膜性肾病。患者均在入院后行急诊手术，术中取AD患者病变组织。组织取出后用预冷的0.9%氯化钠注射液漂洗，一部分冻存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋用于进行后续检测。另选取5例心脏移植患者作为对照组(此5例患者均无大血管疾病，其在心脏移植术中取下的心脏主动脉血管可作为相对正常主动脉血管组织)。术前所有实验方案均已告知家属，并签署知情同意书，且该部分实验经武汉大学医学伦理学委员会审批同意[伦理审批编号：WDRM动(福)第20201107号]。

2.实验动物与模型构建：选用SPF级野生型4周龄SD大鼠18只，实验动物均由武汉大学动物实验中心提供[动物使用许可证号：SYXK(鄂)2015-0027]，饲喂于武汉大学人民医院动物实验中心。将实验动物采用数字表法随机分为AD组(n=9)及对照组(n=9)。AD组饲喂含0.3%β-异氨基丙腈酯(BAPN)的维持饲料进行主动脉夹层动物模型构建，对照组饲喂普通饲料。动物模型构建后密切观察造模大鼠生存状况，若大鼠在造模过程中死亡，立即解剖明确死因，并收集主动脉撕裂范围的主动脉组织标本。4周后各组存活大鼠统一取材(AD组取主动脉撕裂部位，对照组取相应部位血管)，主动脉标本液氮冻存或4%多聚甲醛固定用于后续实验。

3.氧化应激细胞模型构建：培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC)至80%后，实验组加入不同浓度的H2O2，对照组不做处理。

4.实验试剂：PRDX3抗体购自中国北京Bioss生物技术公司；β-氨基丙腈酯(BAPN)购自日本TCI公司(货号A0796)；β-actin抗体购自中国武汉Servicebio生物技术公司；抗兔二抗购自美国Cell Signaling Technology公司(货号：5151P)。

5.Western blot法实验：按照分组要求处理组织后，取约100mg组织于1.5ml EP管内，加入含有适量比例的Cocktail及PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，液氮研磨仪研磨组织。所得样品于冷冻离心机中以4℃ 12000r/min离心20min，取上清，所收集上清液置于冰上超声碎裂。根据所获得蛋白上清液的体积，以适当的比例加入5×蛋白上样缓冲液混匀，100℃金属浴15min，所获蛋白样本冻存于-80℃冰箱中。每孔蛋白上样量为10μg，电泳电压90V，电流40mA，以12%SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶进行Western blot法电泳。在电流200mA，电压100V条件下电转2h。其后TBST洗膜，5%脱脂奶粉封闭1.5～2.0h，一抗(anti-PRDX3)4℃摇床孵育过夜，β-actin为内参，以山羊抗兔荧光二抗显影，在Odessy荧光扫膜系统上扫膜，并对结果进行半定量分析。

6.免疫组织化学实验：各组标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后进行切片。选取适量切片后将切片置于65℃恒温烘箱中加热融蜡2h，然后放入二甲苯溶液中脱去残留的石蜡，进行常规的水化步骤后用PBS漂洗。用triton试剂破膜15min，而后在枸橼酸缓冲溶液中进行微波加热修复。自然冷却后，用3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，血清常温封闭1h，一抗4℃孵育过夜。室温复温1h，二抗避光孵育1h。用DAB染色液在显微镜下显色，显色后苏木精染核，盐酸乙醇分化，漂洗干净后进行风干，中性树脂封片，最后在全自动显微镜下观察拍照。

7.统计学方法：以Graghpad软件进行统计学处理，至少取3次独立实验结果。计量资料的两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组人体主动脉组织中PRDX3表达比较:Western blot法检测发现，AD组患者主动脉血管PRDX3的表达在mRNA水平及蛋白水平均较对照组主动脉明显增高，差异有统计学意义(P=0.000，图1)；人体组织免疫组化结果显示，AD患者主动脉组织中PRDX3表达较对照组明显增高，表现为显微镜下主动脉血管中膜中出现大量高表达的阳性型号(图2)，用Image J软件进行阳性率统计分析发现，AD组与对照组之间比较，差异有统计学意义。

图1 Western blot法检测人体组织PRDX3表达

图2 人体主动脉组织标本间免疫组织化学染色

2.两组大鼠主动脉组织中PRDX3的表达:免疫组化染色结果发现，AD组较对照组PRDX3表达明显增高，表现为显微镜下主动脉组织胞质中出现大量高表达的阳性型号(图3)。

图3 大鼠主动脉组织免疫组织化学染色

3.不同组H2O2浓度下HVSMCs表达PRDX3的比较：HVSMCs培养至80%加入过氧化氢处理后，Western blot法检测发现，H2O2实验组PRDX3的表达随着H2O2浓度的升高而增高(图4)，并在蛋白水平较对照组明显增高，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图4 Western blot法检测细胞模型内PRDX3表达

讨 论

本研究发现，AD患者主动脉组织中过氧化物还原酶3的表达在mRNA水平及蛋白质水平均较正常对照主动脉组织明显增加，提示在主动脉夹层发病过程中线粒体氧化应激水平明显升高。同时在免疫组化染色中发现，在胞质中出现的大量阳性信号也提示在线粒体中可能发生了氧化应激水平的升高，表现为AD组中PRDX3的表达较正常对照组的明显增高。但是由于人体组织标本之间存在的年龄、性别、家族遗传、生活条件差异性可能带来不可避免的误差，会导致样本均一性相对较差。为此本研究构建了大鼠主动脉夹层动物模型，进一步证实线粒体应激相关蛋白PRDX3的表达升高可能与主动脉夹层具有密切的联系。

主动脉夹层作为一类致死率极高的主动脉疾病，其病理变化表现包括主动脉血管平滑肌细胞的丢失和凋亡过多，弹力纤维断裂，细胞外基质胶原沉积过多[4]。既往研究更多地涉及血管组织的中膜结构，而对于线粒体这一细胞内重要细胞器涉及较少。线粒体作为体内主要的供能细胞器，其功能失调会导致内环境系统的紊乱[5, 6]。同时线粒体是大量的氧化还原反应的场所所在，主动脉夹层的发生、发展涉及多个器官系统的功能失调，细胞内超氧离子的聚集导致线粒体膜电位下降线粒体结构损伤从而功能受损，最终导致细胞凋亡发生主动脉夹层。线粒体对氧化还原应激的适应性反应可能涉及线粒体通道，如线粒体通透性转换孔(MPTP)和内膜阴离子通道(IMAC)。它们的激活导致线粒体内和线粒体间氧化还原环境的改变，从而导致ROS的释放[7]。AD的发展进程中长期全身炎性介质的释放可能参与其中，带来的是过量的ROS产生和聚集，而ROS的上升超过“正常”或“生理”的阈值水平，会导致一种通常被称为“氧化应激”的过程[8,9]。在正常生理条件下，线粒体负责细胞内大部分H2O2的产生，ROS也能作为细胞内信号分子发挥作用，既往研究已经证明，H2O2可以诱导血管平滑肌细胞(VSMC)的表型改变，促进细胞凋亡，从而导致钙化等血管病变[10，11]。

过氧化还原蛋白(peroxiredoxin，PRDX)是一个高度保守的过氧化物酶家族，其维持细胞内活性氧(ROS)的动态平衡[12]。该家族成员在大多数生物体中都有表达并参与各种生物学过程，在活性氧(ROS)产生、炎症、肿瘤、动脉粥样硬化、心力衰竭等中均发挥相应作用[13～16]。哺乳动物线粒体产生过量活性氧(ROS)所致的线粒体损伤是许多疾病中氧化损伤的基础。氧化应激下线粒体产生的过量活性氧(ROS)可导致线粒体蛋白质、线粒体膜和DNA的氧化损伤，损害线粒体合成ATP及其广泛代谢功能的能力，包括对大多数细胞正常运转至关重要的三羧酸循环、脂肪酸氧化、尿素循环、氨基酸代谢、血红蛋白合成和FeS中心组装[17]。线粒体氧化损伤时还可以通过增加细胞色素C(cyt C)等膜间隙蛋白从而激活细胞凋亡[18]。PRDX3作为一种内源性过氧化物清除剂，在正常生理情况下，PRDXs的产生与ROS处于动态平衡的状态[19]。当发生主动脉夹层等疾病导致内环境稳态失调，线粒体氧化应激产生大量的ROS，随之而来的是线粒体内的过氧化物清除剂-过氧化还原蛋白PRDX3的升高，用以清除过量的ROS。主动脉夹层发生时产生的大量ROS时伴随而来的是机体随之而来的PRDXs的上调，当上调的PRDXs不足以清除过量的ROS时，过量的ROS会导致线粒体破碎，平滑肌细胞凋亡，最终导致主动脉夹层的发生。

综上所述，在主动脉夹层的发生、发展过程中，ROS的爆发可以导致线粒体氧化应激的发生，使线粒体氧化应激相关过氧化还原蛋白PRDX3上调；如果过氧化清除剂-PRDX3的产生不足以清除过量的ROS，线粒体稳态无法恢复，过量的ROS则会使得线粒体功能受损、破裂，同时诱导细胞凋亡，最终促进主动脉夹层的发生、发展。对主动脉夹层发病机制的进一步探究能够揭示主动脉夹层这一危险疾病的发病机制，从而为未来主动脉夹层的早期治疗提供新的治疗思路及靶点。