二氢杨梅素和杨梅苷抑制HepG2 细胞的协同作用

陈秋平，林心健，李申兰，刘合生，戚向阳

（浙江万里学院食品系，浙江宁波 315100）

藤茶，是一种古老的药食两用植物，已被批准为新资源食品，它具有抗菌消炎、降血脂、抗氧化等多种功效[1-2]。近年研究发现其具有广谱的抗癌作用，对肝癌细胞、人胚肾细胞、前列腺癌细胞的增殖抑制作用显著[3-5]。龚金炎等[6]研究发现藤茶提取物及其主要活性单体二氢杨梅素对前列腺癌PC-3 细胞有明显的抑制作用，但其主要活性因子二氢杨梅素对PC-3 细胞的作用弱于藤茶提取物，表明藤茶中可能存在其他活性因子，其与DMY 有协同增效的作用。天然植物中的活性成分是混合存在的，许多纯化后的单体的活性弱于天然植物的粗提物，其活性可能是不同功能因子相互作用的结果。藤茶中的主要活性成分为二氢杨梅素（DMY）、杨梅苷（MYT）、杨梅素等[7-8]，含量约为0.3%～34.19%、0.07%～1.71%、0.0007%～0.33%[9-11]。研究发现DMY 和MYT 能够诱导HepG2 细胞凋亡而抑制细胞的增殖[12-13]，基于天然产物整体观，本试验主要探究藤茶中的主要黄酮DMY 和MYT 之间的联合作用，探索二者联用对HepG2 细胞增殖的协同作用，以期确定二者的最佳配比，为藤茶的后续研究以及开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

HepG2 细胞 上海细胞库；胎牛血清 北京全式金生物技术有限公司；RPMI 培养基、胰蛋白酶Hyclone 公司；Hoechst33342 染色液 碧云天生物技术公司；二氢杨梅素标准品、杨梅苷标准品、四甲基偶氮唑盐（MTT）北京索莱宝科技有限公司。

MCO-15AC 二氧化碳培养箱 日本三洋；MLS-3751L 高压蒸汽灭菌锅 日本松下；HFsafe-1500 生物安全柜 力康仪器有限公司；5804R 离心机 爱本德中国有限公司；DNP-9272A 恒温培养箱 上海贺德实验设备有限公司；酶标仪 瑞士TECAN；Ts2R 倒置荧光显微镜 日本尼康。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养 在无菌条件下，将HepG2 细胞接种于含10% FBS 的RPIM-1640 培养基中，于温度为37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，隔天换液。当细胞生长密集时，使用0.25%胰蛋白酶消化传代后继续培养[14]。

1.2.2 MTT 法测定细胞增殖抑制率 细胞铺板及给药：将HepG2 细胞消化后，以3000 cell/孔的密度接种至96 孔板，细胞贴壁后给药。将DMY 和MYT用二甲基亚砜（DMSO）配制成100 mmol/L 的母液，使用时用培养基稀释，以获得所需的浓度，并保证DMSO 的最终浓度在培养基中小于0.5%。为了评价DMY 和MYT 的联合作用，使细胞抑制率能更合理分布将细胞用DMY（20、40、60、80 和100 μmol/L），MYT（20、50、100、200 和300 μmol/L），以及DMY和MYT 配伍组（以DMY 为固定浓度10、20、30、40、50 μmol/L，MYT 按DMY:MYT 分别为1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1 的比例加入；当DMY:MYT=1:4 时，若DMY 仍以10～50 μmol/L 的浓度，细胞抑制率偏高，因此调整DMY 浓度为5、10、15、20、25 μmol/L，MYT 按DMY:MYT 为1:4 的比例加入）处理72 h，每个样品5 个复孔。每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，将细胞继续于培养箱中培养4 h，离心后，小心吸弃培养基，每孔中加入150 μL的DMSO，避光振荡10 min 使晶体溶解，490 nm 处测定其吸光度，计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=1-OD样品/OD空白对照×100%[15]。

1.2.3 细胞Hoechst 荧光染色 HepG2 细胞悬液均以3×104cell/孔的密度接种于24 孔板中，24 h 后，待细胞在24 孔板中贴壁后，加入单体或合用单体的使其在培养基中的浓度为60 μmol/L，培养72 h 后，吸弃原培养基，用PBS 洗涤2～3 次，每孔加入Hoechst 33342 染色液400 μL，染色20～30 min 后，弃染色液，用PBS 洗涤3 次后进行荧光拍照[16]。

1.2.4 协同作用分析 合用指数（CI）可通过IC50值的计算进一步对两种样品的协同、拮抗或相加效应进行分析[17-18]。将单体或合用单体对细胞抑制率用Calcusyn2.0 软件进行分析，计算DMY 和MYT在单用和联用时各自的IC50值和样品的CI 值。

以DMY 和MYT 两种样品的IC50分别为X、Y 值，作直线连接DMY 和MYT 单用时的IC50值，此直线即为等效线，然后分别以DMY 和MYT 联用时细胞抑制率为50%时，两个单体的浓度为横纵坐标绘制不同的点，若此点在等效线下方则为协同作用，落在线上则为相加作用，在等效线上方则为拮抗作用[19-20]。

1.3 数据处理

采用Calcusyn2.0 软件对DMY 和MYT 的合用指数进行分析，并使用Origin 9.0 作图。

2 结果与分析

2.1 二氢杨梅素和杨梅苷对HepG2 肿瘤细胞增殖的抑制作用

由图1 可知，DMY 和MYT 单一作用下均可抑制HepG2 细胞的增殖，呈剂量依赖效应。DMY 对HepG2 细胞的IC50为56.46 μmol/L；MYT 对HepG2细胞的IC50为95.01 μmol/L，表明DMY 对HepG2细胞增殖的抑制作用强于MYT。

图1 二氢杨梅素和杨梅苷对HepG2 细胞的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of dihydromyricetin and myricetin on HepG2 cell proliferation

2.2 二氢杨梅素和杨梅苷联用对HepG2 肿瘤细胞增殖的抑制作用

如图2 所示，DMY 和MYT 分别以 1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1 的比例作用于HepG2 细胞时，随着混合单体浓度的提高，细胞的增殖抑制率也逐渐提高，呈剂量依赖效应，IC50如表1 所示，当混合单体DMY:MYT=1:4 时，IC50最高，为73.00 μmol/L，介于DMY 和MYT 之间；1:2～8:1 混合单体的IC50均低于DMY 和MYT，提示混合单体对HepG2的抑制作用强于单一单体，表现出明显协同作用，其中DMY:MYT=1:1 组的IC50最小，为40.90 μmol/L，分别是DMY 和MYT 单独作用时的72.4%和43.0%，这可能是由于DMY 和MYT 对HepG2 细胞的不同通路和靶点，实现了药效协同，二者联用能够在降低剂量的同时保证效果。

图2 不同配比的二氢杨梅素和杨梅苷对HepG2 细胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different ratio of dihydromyricetin and myricetin on HepG2 cell proliferation

表1 不同样品对HepG2 作用的IC50Table 1 IC50 value of different sample on HepG2 cell

进一步的荧光染色结果显示（图3），HepG2 细胞给药72 h 后，与空白对照组相比，给药组细胞数量明显降低，细胞荧光强度增加，表明其能促进细胞的凋亡，其中联合用药组的细胞数与DMY 相近，MYT 对细胞的作用效果较其他组弱。

图3 荧光染色法评价混合单体对细胞增殖的协同作用Fig.3 Evaluation of mixeddrugs synergy on cell proliferation by fluorescence staining

2.3 二氢杨梅素和杨梅苷对HepG2 细胞增殖的协同作用分析

CI 值常用于评价单体协同的效果，其值为0.3～0.7 时为协同作用，0.7～0.85 为中等协同作用，0.85～0.90 为弱协同作用。根据单体和混合单体对HepG2 肿瘤细胞的作用，采用Calcusyn2.0 软件计算得到二者的在HepG2 肿瘤细胞IC50处的CI 值，如图4 所示，当二者按1:4～8:1 的配伍比例时，随着混合物中DMY 的比例增加，CI 值呈现先下降后上升的趋势，当二者比例为1:2～1:1 时呈现协同作用，2:1～8:1 时呈中等协同作用，1:4 时为弱协同作用。

图4 合用指数法评价混合单体抑制HepG2细胞增殖的协同作用Fig.4 Evaluation of mixed drugs synergy on HepG2 cell proliferation by Combination index

等效曲线法分析评价二者的协同作用，结果如图5 所示，1:4～8:1 的混合单体的点均落在等效曲线下方，提示二者呈现协同作用。

图5 等效线法评价混合单体抑制HepG2细胞增殖的协同作用Fig.5 Evaluation of mixed drugs synergy on HepG2 cell proliferation by isobole analyse

3 讨论与结论

近年对藤茶的研究，大多集中在其主要活性因子DMY，它具有多种生理活性，包括抗炎、降脂、抗癌等作用[21-22]，尤其是对不同的肿瘤细胞，呈现出广谱抗癌特性[6,13,23-24]。由于机体代谢是非常复杂的过程，摄入的不同物质间存在相互影响，进而引起药效的改变。我国中医中药常将多种药材联合使用，组成复方，实现药效协同，从而达到对疾病有效治疗[25]。徐容容等[12]研究发现杨梅素和MYT 联用后对可以有效提升对人前列腺癌细胞系PC-3 的增殖抑制和诱导凋亡的作用。江湧等[26]研究发现β-细辛醚、丁香酸联用较单独的化合物更能有效地保护PC12 细胞免受淀粉样蛋白毒性损伤。Tomas-Hernández 等[14]研究发现白藜芦醇和槲皮素联用时，能够促进HepG2 细胞的自噬，并影响了促凋亡信号传导。但是这些研究只是对成分的作用效果进行简单的加减比较，并未进行科学的计算分析评价成分间的协同作用。CI 值近年常用于的评价药效协同作用，当其小于1 时，表明存在协同作用[27]。本试验为了更准确评价DMY 和MYT 间的协同作用，设置了1:2～8:1 梯度浓度，分析二者对HepG2 增殖的相互影响，结果表明该浓度范围内，CI 值均小于1，当二者比例为1:1 时，CI 最低为0.6，呈现协同作用。等效曲线法是另一种常用的药效协同评价方法，结果也进一步证实了DMY 和MYT 存在药效协同，二者联用，对HepG2 抑制达到相同效果时，混合单体的用量可以低于单一药物，可以达到减少剂量，降低成本的效果。肿瘤是机体多途径失调的复杂疾病，对于它的治疗也有很多不同靶点，不同的活性分子组合后，可实现多靶作用，提高药效，降低药量，但是组合物的协同机理较复杂，有关DMY 和MYT 的协同的机理仍需后续研究进一步探索。

二氢杨梅素及杨梅苷对HepG2 细胞的增殖具有抑制作用，二者联用时可明显提升对HepG2 细胞活力的抑制作用。CI 值法和等效曲线法均表明DMY:MYT 在1:4～8:1 呈现协同增效作用，其中当浓度比 DMY:MYT=1:1 时，协同作用最强。这为藤茶的功能的进一步探究和应用提供了新的思路。