云南小粒咖啡类黑精荧光矩阵光谱特征

赵林芬，王燕华，王晓婷，弘子姗，刘艳芳，龚加顺，谭 超，刘华戎

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

咖啡是世界三大无酒精饮料之一[1]。咖啡的棕褐色主要来源于咖啡中类黑精，它是由半缩醛羟基化合物与氨基化合物发生美拉德反应形成的高分子聚合物[2]。其形成过程尚未明确[3-6]。除咖啡中含有类黑精外，面包等烘焙食品中也含类黑精[7]。烘焙咖啡中类黑精含量约占其干重的16.0%～17.0%[8]。咖啡类黑精具有一定减肥和对肝脏的保护作用[9]，在体内能清除α-二羰基化合物[10]，减少脂质过氧化产物和二次脂氧化产物的合成[11]。但摄入过多会产生活性氧基团，导致细胞死亡和凋亡现象的发生[12]。

目前，类黑精的制备方法主要有醇沉、浸提、大孔树脂吸附、酶解法等[13-14]。检测方法主要有高效液相色谱、紫外可见光分光光度法、电喷雾电离质谱和串联质谱[6,15-16]等。这些检测方法可靠，但存在设备昂贵和前处理复杂的缺点。三维荧光矩阵光谱分析是一种指纹鉴定技术[17-18]。是由激发波长（y 轴）、发射波长（x 轴）、荧光强度（z 轴）三维坐标所表征的矩阵光谱。表示形式包括等角三维投影图和三维等高线光谱图[19]。相对于传统的检测方法，三维荧光矩阵光谱分析灵敏度高，选择性好，样品需求量少，前处理简单[20]。主要用于水质污染检测、食品添加剂、植物油种类的快速鉴别[21-22]。

为研究咖啡类黑精在不同环境条件下的荧光光谱特征变化，本文以云南小粒咖啡为原料提取类黑精，研究咖啡类黑精在不同温度、不同pH、不同光照及存放时间、不同浓度条件下的荧光光谱特征变化，为咖啡类黑精光谱特征的深入研究提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

云南小粒咖啡粉 中度烘焙，广州伊蕴丽贸易有限公司；实验室超纯水、实验室纯水、市售纯净水、市售山泉水、市政自来水、无水乙醇 天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠、盐酸 重庆川东化工集团有限公司；分析试剂 均为AR 级。

PGX-260A 多段可编程光照培养箱 宁波东南仪器有限公司；HH-8 数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；F97Pro 型荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司；SK3200HP 超声波清洗机 上海科导超声仪器有限公司；AR224CN 电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡类黑精的制备 中度烘焙的云南小粒咖啡粉，按料液比1:2（m/v）加超纯水于80 ℃浸提30 min，重复3 次，随后合并滤液于4000 r/min 离心15 min，取上清液旋转蒸发至500 mL，咖啡浓缩液与无水乙醇体积比为3:7（v/v），醇沉3 h，再4000 r/min 离心15 min 收集沉淀，最终冷冻干燥得咖啡类黑精粗提物[23]。

1.2.2 三维荧光矩阵光谱（3D-EEMs）及二维荧光矩阵光谱（2D-EEMs）检测参数设定 3D-EEMs 用于咖啡类黑精指纹光谱特征研究，从中找出咖啡类黑精特征峰；2D-EEMs 基于3D-EEMs 特征峰用于不同温度、不同pH、不同光照及存放时间、不同浓度条件下的荧光光谱特征变化研究。3D-EEMs 参数设置：扫描波长200～900 nm，激发波长（Excitation wavelength,λex）=200～900 nm，每隔10 nm 激发扫描一次，扫描速度为3×104nm/min，激发带宽、发射带宽为10 nm，光电倍增管增益（Photomultiplier Tube,PMT）=900 V，响应时间自动匹配。2DEEMs 参数设置：激发模式下，发射波长（Emission wavelength,λem）=457.8 nm，λex=240～520 nm，扫描速度为300 nm/min，宽带10 nm，PMT=900 V。发射模式下，λem=377.7 nm，λex=300～700 nm，扫描速度为300 nm/min，宽带10 nm，PMT=900 V。在两种模式均为波长扫描，数据方式为荧光模式，相应时间自动匹配，重复1 次，无时间间隔。

1.2.3 水质对荧光光谱图的影响 对比实验室超纯水、实验室纯水、市售纯净水、市售山泉水、市政自来水的3D-EEMs 光谱图，筛选出最优冲泡用水。

1.2.4 温度对咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响一杯美式咖啡浓度按100 mg/mL 算，根据咖啡类黑精提取率折算得到一杯美式咖啡中类黑精浓度为2.96 mg/mL。取8 份2.96 mg/mL 的类黑精水溶液，分别在10、20、30、40、50、60、70、80 ℃温度条件下进行2D-EEMs 测定。

1.2.5 pH 对咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响取12 份浓度为2.96 mg/mL 咖啡类黑精水溶液，分别用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCI 调节pH 至1～12 进行2D-EEMs 测定。

1.2.6 不同光照及存放时间对咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响 配制2.96 mg/mL 的类黑精水溶液，在避光和光照（3000 Lx）条件下测定0、10、20、30、40、50、60 min 不同时间条件下2D-EEMs 光谱变化。

1.2.7 咖啡类黑精水溶液浓度对其荧光强度的影响

咖啡饮品种类繁多，其中的咖啡类黑精含量也各不相同。类黑精浓度相对较低的咖啡以美式咖啡为代表，类黑精浓度较高的咖啡以意式浓缩咖啡为代表。根据冲泡一杯美式或意式浓缩咖啡的粉水比及烘焙咖啡豆中类黑精含量折算，得到不同咖啡饮品中咖啡类黑精理论浓度范围约1.08～85.00 mg/mL。设置两组不同浓度梯度的咖啡类黑精溶液测定荧光强度。低浓度组（0.00～0.50 mg/mL）：称取咖啡类黑精用超纯水配制0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL类黑精水溶液进行2D-EEMs 测定。高浓度组（0.00～60.00 mg/mL）：称取咖啡类黑精用超纯水配制0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00 mg/mL的类黑精水溶液进行2D-EEMs 测定，实际测试中发现咖啡类黑精浓度＞60 mg/mL 无法完全溶解，未对更高浓度咖啡类黑精水溶液荧光强度进行测试。

1.3 数据处理

采用F97Pro 型荧光分光光度计软件Prolab 6.5.1.3009 进行数据统计和处理，取三次平行结果。

2 结果与分析

2.1 水质对荧光光谱图的影响

在以水为溶剂的3D-EEMs 光谱图中，由于入射光子和水中微粒作用会产生干扰性的瑞利散射和拉曼散射[24]。水中可激发荧光的物质越少，则3DEEMs 光谱图中除瑞利散射、拉曼散射、倍频峰外的区域越干净。对比实验室超纯水、实验室纯水、市售纯净水、市售山泉水、市政自来水的3D-EEMs 光谱图（图1）。五种不同的水均出现瑞利散射、拉曼散射和倍频峰线。实验室超纯水的瑞利散射、倍频峰比其他四种水短，实验室超纯水、实验室纯水、市售纯净水的3D-EEMs 光谱图均较为清晰，出峰效果较好，说明水中基本无杂质。而市售山泉水在拉曼光谱附近出现细微杂质峰，市政自来水在瑞利散射周围及倍频峰（上）附近出现较大杂质峰，说明水中杂质较多。分析时选择实验室超纯水、实验室纯水或市售纯净水配制类黑精。

图1 不同溶剂水的三维荧光等高线光谱图Fig.1 Contour map of 3D-EEMs of water with different solvents

2.2 云南小粒咖啡类黑精3D-EEMs 图谱特征

3D-EEMs 荧光光谱包含共轭双键的分子信息，可推测溶液中化合物共轭情况。浓度为2.96 mg/mL的类黑精水溶液λex=250～600 nm，λem=300～700 nm范围内出现荧光峰（图2）。不同的λex/λem区域对应于不同化合物共轭双键的分子信息：区域Ⅰ（λex/λem=220～250 nm，280～330 nm）为含芳环的蛋白质类，如酪氨酸等低分子物质；区域Ⅱ（λex/λem=220～250，330～380 nm）为可降解的溶解性有机物；区域Ⅲ（λex/λem=220～250 nm，380～550 nm）为富里酸，含有大量碳水化合物，少量芳香基和烷烃；区域Ⅳ（λex/λem=250～340 nm，280～380 nm）为溶解性微生物分解副产物蛋白类物质，如色氨酸；区域Ⅴ（λex/λem=220～250 nm，＞380 nm）为类腐殖质酸，含有羧基和羰基结构[25]。咖啡类黑精3D-EEMs 图中包含2 个明显的荧光峰位λex/λem=380 nm，450 nm 和λex/λem=470 nm，525 nm，与上述五区无对应，可能是类黑精水溶液中的各基团相互作用减小了电子之间的能级间距，λex发生红移。最大λem介于III 区和IV 区附近，推测咖啡类黑精中可能含有羰基、羰基结构或芳香基、烷烃等基团。

图2 云南小粒咖啡咖啡类黑精水溶液三维等高线光谱图Fig.2 Contour map of 3D-EEM of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.3 温度对云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响

咖啡类黑精水溶液在10～80 ℃、λex=320～435 nm 范围内荧光特性具有一定差异（如图3）。λex=320～340 nm 时咖啡类黑精荧光强度随着λex增长而缓慢增加，340～400 nm 时咖啡类黑精荧光强度随着λex增长而急速增加，并在λex=400 nm 时达到峰值，λex＞400 nm 荧光强度逐渐降低，下降趋势与温度成反比，温度越低下降趋势越明显；在λex最大时，咖啡类黑精荧光强度峰值与温度成反比，温度越低，荧光强度越高。这与尚宏美[26]以及叶君等[27]的研究一致，即温度升高会使分子运动加快，分子发生更多碰撞释放更多能量导致用于产生荧光的能量减少、荧光产生效率降低，荧光强度降低。

图3 温度对云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响Fig.3 Effect of temperature on the fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.4 pH 对云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响

不同pH 条件下咖啡类黑精水溶液在λex=340～430 nm 范围内的荧光特性，如图4 所示。pH=4 时荧光强度出现最大值3734.50，λex=397 nm；在pH＜4 的酸性环境中，酸性越强荧光强度越低；pH 在4～5 之间荧光强度从3734.50 迅速降低至约3000；当pH 介于5～10 之间荧光强度平缓，溶液pH=7 时达到此段高点，在此范围内溶液碱性越强，荧光强度越低，在pH=9～10 荧光强度无明显变化；当pH＞10，荧光强度突然急剧下降发生荧光猝灭现象，至pH=12 时荧光强度最低为132.50。pH 变化不仅会改变溶液酸碱度，也会影响溶质分子的荧光，pH 变化会导致带有酸性或碱性取代基的大多数芳香族化合物溶液电离平衡发生移动，导致荧光强度和光谱发生变化。其根本原因是当分子的酸碱度发生变化时，分子结构的变化是不同的，当分子处于不同的pH 时，其吸收和发射荧光的能力会受到影响，荧光光谱会有所不同[26]。

图4 pH 对云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响Fig.4 Effect of pH on the fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.5 不同光照及存放时间对云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度的影响

咖啡类黑精水溶液在避光和3000 Lx 光照下，随着存放时间的增加，溶液荧光强度发生变化（图5）。避光存放30 min 的类黑精水溶液荧光强度缓慢增加，30～40 min 荧光强度逐渐降低，40 min 后荧光强度随避光时间增加而逐渐增加，避光50 min 后荧光强度达到最大值3792.00，但总体来看避光存储的类黑精水溶液在60 min 内荧光强度变化不显著（P＞0.05）。在3000 lx 光照条件下，随存放时间增加咖啡类黑精水溶液荧光强度逐渐降低，60 min 时荧光强度最低为3148.50，且与0 min 时对比显著降低（P＜0.05）。当咖啡类黑精分子被特定波长的光持续照射，吸收被照射光的能量并脱离原来的稳定状态，荧光强度随之下降。

图5 不同光照及存放时间对类黑精水溶液荧光强度的影响Fig.5 Effects of the different lighting and storage time on fluorescence intensity of aqueous solutions of melanoidins from Yunnan arabica coffee

2.6 不同浓度云南小粒咖啡类黑精水溶液的荧光强度

云南小粒咖啡类黑精溶液在0.00～0.50 mg/mL浓度条件下，溶液浓度与荧光强度呈线性关系，y=7492x+213.5（R2=0.9846）（见图6）。随着类黑精浓度增高至20.0 mg/mL，溶液中类黑精浓度增大，聚合物配体的结构稳定性随类黑精交联度的增加而变化，配体的能级不再匹配，配体的能量转移效应降低，发光效率降低，荧光强度降低。部分荧光被类黑精自身吸收，导致荧光猝灭，使得咖啡类黑精荧光强度陡然下降。

图6 不同浓度云南小粒咖啡类黑精水溶液的荧光强度Fig.6 Effects of the different concentration on fluorescence intensity of Melanoidin aqueous solution

3 结论

以中度烘焙的云南小粒咖啡为原料制备类黑精，研究不同温度、不同pH、不同光照及存放时间、不同浓度条件下的荧光光谱特征变化。结果表明，在10～80 ℃范围云南小粒咖啡类黑精水溶液荧光强度与温度成反比；pH 介于5～10 之间的类黑精水溶液荧光强度较为稳定；避光存储的类黑精水溶液在60 min 内荧光强度变化不显著（P＞0.05），而光照时间增加会导致荧光强度显著下降（P＜0.05）；在浓度小于0.5 mg/mL 时，类黑精水溶液荧光强度与浓度成正比，相关系数为0.9846，浓度大于10 mg/mL 时会发生荧光猝灭，类黑精水溶液荧光强度与浓度不相关。