石墨烯/四氧化三钴电化学传感器的建立及饼干中香兰素检测分析

司晓晶，韩婧婷，朱文菁，黄 玥，白 晨，马颖清

（1.上海商学院食品系，上海 200235；2.上海市农产品质量安全中心，上海 201708）

香兰素，作为一种食品工业中常用的增香剂，已渗透进我们的日常饮食中，常用作巧克力、冰激凌、糖果、饼干、蛋糕、面包等的添加剂[1]。香兰素气味浓郁，新生儿若长期摄入可能对其形成依赖性，并养成挑食的习惯，同时还可能对其肠胃有一定的副作用，影响正常的生长发育，过量食用会造成头晕恶心、呕吐腹泻等症状，甚至影响人体肾脏和肝脏的工作[2]。各个国家都对香兰素的添加量严格管控，我国在GB 2760-2014 食品用香料使用中规定，香兰素严禁加入6 个月以内婴幼儿奶粉及一些杀菌乳等奶制品中，然而目前尚未制定标准检测方法[3]，所以建立快速有效简便的香兰素检测方法尤为必要。

目前主要的香兰素检测方法有紫外分光光度法[4-5]、荧光分光光度法[6]、拉曼光谱法[7]、毛细管电泳法[8]和高效液相色谱法[9-11]及色谱-质谱联用方法等[12-14]。但这些方法存在前处理过程繁琐、设备仪器昂贵或灵敏度、准确性不高等问题。然而，近年来电化学分析方法的快速发展及其表现出的检测优势，促使人们越发倾向于采用此法对香兰素进行检测[15-19]。

石墨烯（graphene，GR），因其具有大的比表面积、良好的机械性能和电子传递效率，在电化学传感器方面，有较好应用基础和前景[20-22]。Co、Ni、Au、Cu 等都是当今研究较深入的应用于电催化的金属，这些金属元素在电化学反应中具有较高催化能力、较大表面积和较高热稳定性，因而在电化学领域中极具潜力[23-25]。所以，本文先将GR 滴涂到裸的玻碳电极（glass carbon electrode，GCE）表面，再在Co（COOH）2溶液中通过循环伏安法（Curve of cyclic voltammetry，CV）电聚合，得到Co3O4/GR/GCE 修饰电极，作为香兰素检测的电化学传感器，由于该传感器测得的电信号与香兰素的浓度呈一定相关性，因此可实现香兰素定性定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

GR（单层，片径0.5～5 μm，厚度约0.8 nm，物理法制得）南京先丰纳米材料科技有限公司；甘氨酸、丙氨酸、精氨酸等氨基酸 探索平台；香兰素、无水乙醇、浓硫酸、乙酸钴等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；超纯水 为实验用水；0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffer solution，PBS）为支持电解质溶液；袋装原味夹心饼干 超市。

CHI 660D、842B 电化学工作站 上海辰华仪器有限公司；S-4800 扫描电镜 日本HITACHI 公司；KQ 218 型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；FA2204B 分析天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 电化学传感器的制备 GCE 预处理：将GCE作为工作电极，在麂皮板上用0.05 μm 的Al2O3粉末打磨抛光，依次用无水乙醇、超纯水超声清洗5 min，0.5 mol/L H2SO4溶液中-1～1 V 电位窗下CV 法活化10 圈，超纯水冲洗干净。

称取2 mg 的GR 分散在2 mL 的超纯水中，100 W，40 kHz 下超声2 h 分散均匀得到浓度为1 mg/mL的GR 分散液。滴涂在预处理后的GCE 上，红外干燥灯下干燥40 min，得到GR/GCE 修饰电极。接着将GR/GCE 电极放入含有0.02 mol/L Co（COOH）2溶液中，-0.8～1.6 V 电位窗下，CV 法电聚合20 圈，即得到复合修饰电极Co3O4/GR/GCE。在这个步骤中，Co(COOH)2因发生电化学氧化反应生成Co3O4，金属Co 纳米粒子的聚合使该修饰电极的电化学性能得到很大的提高[26]。制备结束后，将修饰好的电极用超纯水小心清洗，以便进一步使用。对得到的GR/GCE 和Co3O4/GR/GCE 修饰电极进行电子扫描电镜（Scanning electron micrograph，SEM）表征。

同时，另取一支干净的GCE 于0.02 mol/L Co(COOH)2溶液中，-0.8～1.6 V 电位窗下，CV 法聚合20 圈得到Co3O4/GCE 修饰电极，超纯水清洗后备用。

1.2.2 实验样品的预处理 称取5 g 饼干充分研磨成粉末，溶解于10 mL 去离子水中，100 W，40 kHz下10 min 使充分溶解，然后将悬浮液放在离心机中以3000 r/min 的转速离心2 次，取上清液备用。

1.2.3 测定方法 采用以饱和甘汞电极为参比电极、铂电极为辅助电极、Co3O4/GR/GCE 修饰电极为工作电极的三电极系统，在0～1.0 V 电位范围内，研究扫描速度不断增加下香兰素响应电信号变化情况以确定香兰素在Co3O4/GR/GCE 修饰电极上的响应机理，用差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry，DPV）测定不同PBS 缓冲溶液的pH 对香兰素电信号影响情况，在最优的pH 条件下研究GR 滴涂量和Co(COOH)2聚合圈数的改变下香兰素的电化学行为，建立香兰素的最终实验条件。在该最优实验条件下DPV 检测Co3O4/GR/GCE 修饰电极对不同浓度香兰素的电信号，香兰素浓度为横坐标，电信号为纵坐标确定香兰素线性范围和检出限及进行实际样品中香兰素含量测定。

1.3 数据处理

实验重复3～5 次，数据处理使用软件：OriginPro2015。

2 结果与分析

2.1 Co3O4/GR/GCE 修饰电极的形貌表征

对GR 和制备的Co3O4/GR 导电聚合物分别进行电子扫描电镜（Scanning electron micrograph，SEM）表征，对比其相貌特征观察GR 的褶皱形态及Co3O4是否已成功聚合在玻碳电极表面。图1A 是修饰前的GR 在1 μm 下的SEM 图，呈现出如丝绸般光滑的片状形态，图1B 展示了是Co（COOH）2电聚合到GR 后，形成的Co3O4/GR 纳米复合物在1 μm下的微观形貌，可以明显观察到Co3O4纳米颗粒呈球状均匀附着在GR 表面，同时也说明GR 是一种理想的纳米材料，能够固定吸附交联住金属纳米粒子，GR 大的比表面积提供了Co3O4纳米颗粒均匀结晶、附着和生长的良好环境。因此通过GR 修饰前后的SEM 图，表明Co3O4和GR 已成功聚合。

图1 GR(A)和Co3O4/GR(B)的扫描电镜对比图Fig.1 SEM of GR(A) Co3O4/GR(B)

2.2 香兰素在Co3O4/GR/GCE 修饰电极上的电化学行为

为了比较几种不同修饰电极对香兰素的电化学行为，在本实验中比较了裸 GCE（a）、Co3O4/GCE（b）、GR/GCE（c）和 Co3O4/GR/GCE（d）在20 μmol/L 香兰素的0.1 mol/L pH=4.5 的PBS 溶液中响应值的大小，图2 是各种修饰电极的DPV 图，其电流响应值Ip分别是1.059、1.292、2.049、和3.150 μA。香兰素在裸GCE 上虽有电流响应，但响应值Ip很小，分别以GR 和Co（COOH）2修饰后，Ip明显增加，但当Co（COOH）2和GR 同时修饰到GCE 上时，香兰素的氧化电流值最大，Ip为3.150 μA，几乎具有累加的效果，而且是裸GCE 对香兰素响应值（Ip=1.059 μA）的3 倍。这些数据说明，GR 和Co3O4的结合可以有效增大比表面积，提高电化学传感器的电子传导率和检测样品的灵敏度，Co3O4/GR/GCE 修饰电极作为香兰素的电化学传感器是可行的。

图2 20 μmol/L 的香兰素在不同电极上的DPV 图Fig.2 DPVs of different elctrodes with 20 μmol/L vanillin

为了研究香兰素在Co3O4/GR/GCE 修饰电极上的机理，在0.02～0.22 V/s 的扫描速率下使用CV 法对含有20 μmol/L 香兰素的pH=4.5 的PBS 溶液进行测定（图3），香兰素的Ip随着扫速增加而增大，且电位正向移动，这说明两者的电化学氧化反应是不可逆的[26]。图4 为在pH=4.5 PBS 溶液中Co3O4/GR/GCE 的扫速（ν1/2）和对20 μmol/L 香兰素电流响应的关系图。可以观察到在0.02～0.22 V/s的速率范围内，香兰素的Ip与扫速ν1/2成正相关，线性方程表示为Ip（μA）=6.9759ν1/2+0.3574（R2=0.999），这表明该电极受扩散控制。

图3 20 μmol/L 香兰素在Co3O4/GR/GCE 上不同扫速(0.02～0.22 V/s)的CV 曲线图Fig.3 CVs of the Co3O4/GR/GCE containing 20 μmol/L Vanillin with scan rate ranging from 0.02 to 0.22 V/s

图4 Ip 与υ1/2 间的线性关系图Fig.4 Plots of peak current vs.the square root of scan rate

2.3 对Co3O4/GR/GCE 传感器参数的优化

2.3.1 缓冲液pH 的影响 支持电解质溶液为PBS缓冲溶液，其pH 在一定程度会影响修饰电极的性能。图5A 为pH 从3.5 到5.5 变化时，Co3O4/GR/GCE对20 μmol/L 香兰素Ip的响应情况。可以看到pH 从3.5 增大到4.5，Ip也随之增大。但pH 若继续增大，则Ip出现下降趋势。即当pH=4.5 时，Ip达到最高峰，因此，设定实验体系中PBS 缓冲溶液的pH为4.5。

2.3.2 GR 滴涂量的影响 通过改变滴涂GR 的修饰量来研究其对香兰素氧化电流Ip的影响。图5B是GR 的滴涂量从4.0 μL 增加到12.0 μL 对香兰素Ip的影响。可以观察到在4.0～8.0 μL 范围内，随着GR 的滴涂量增加，香兰素的Ip也呈增加趋势，滴涂量为8.0 μL 时，香兰素的Ip达到最高。然后当GR 滴涂量继续增加到10.0 μL 时，Ip陡然下降。因此，在最终实验中选择滴涂8 μL 的GR 作为理想滴涂量。

2.3.3 Co（COOH）2聚合圈数的影响 导电聚合物修饰电极膜的厚薄一定程度取决于金属溶液的聚合圈数的多少，聚合圈数越多，耗时越长，膜也会变厚。图5C 为电聚合0.02 mol/L Co（COOH）2溶液圈数由10 圈到30 圈变化时，对0.1 mol/L PBS（pH=4.5）中20 μmol/L 香兰素的Ip的影响。由图5C 中可以明显发现，20 圈时Ip最大，但当聚合超过20 圈时，Ip开始下降，这是由于Co3O4修饰膜过厚阻碍了电极表面电子的传递，因此，在Co（COOH）2溶液中电聚合20 圈为最优条件。

图5 Co3O4/GR/GCE 在含有20 μmol/L 香兰素的条件优化图Fig.5 Optimizations of Co3O4/GR/GCE to 20 μmol/L anillin

2.4 香兰素校正曲线

本文在最佳条件下利用DPV 对香兰素进行线性范围和检出限的测定。图6A 显示了在不断搅拌条件下，Co3O4/GR/GCE 在0.1 mol/L PBS 溶液 (pH 4.5) 中连续加入不同浓度香兰素所得的DPV 响应曲线，其香兰素浓度范围为0.1～80 μmol/L。由图6B，可以清楚发现香兰素的Ip随着其浓度的增加而增加，Co3O4/GR/GCE 修饰电极在0.1～80 μmol/L 浓度范围内表现出良好的线性响应，线性回归方程：Ip（μmol/L）=0.1518C+0.5103（R2=0.997），检出限为0.033 μmol/L（S/N=3）。

图6 不同浓度的香兰素在Co3O4/GR/GCE 上的电流响应（A）和香兰素的校准曲线（B）Fig.6 DPVs of Co3O4/GR/GCE at different concentrations of vanillin(A) and vanillin calibration curve（B）

2.5 稳定性和干扰性实验

同一支Co3O4/GR/GCE 修饰电极被用于在0.1 mol/L pH=4.5 PBS 连续平行测定20 μmol/L 香兰素5 次来研究构建的电化学传感器的重复性。把该修饰电极置于4 ℃冰箱中保存14 d 后，再在相同条件下，平行测定香兰素5 次，其Ip减少了3.78%，前后测定的相对标准偏差RSD 均小于2%，其结果见表1。结果说明实验结果表明Co3O4/GR/GCE 对香兰素的检测具有良好的稳定性。

表1 Co3O4/GR/GCE 对香兰素检测的稳定性Table 1 Reproducibility of vanillin on Co3O4/GR/GCE

为了评估Co3O4/GR/GCE 对高灵敏度检测香兰素的选择性能，选择了一些食品中常见的物质加入含有20 μmol/L 香兰素的0.1 mol/L PBS（pH=4.5）溶液中进行检测干扰程度分析。从表2 中可以清楚看出，2000 μmol/L 的NaCl、KCl，1000 μmol/L 的葡萄糖（glucose，Glu）、麦芽糖（sucrose，Suc），500 μmol/L浓度的甘氨酸（glycine，Gly）、丙氨酸（alanine，Ala）、精氨酸（arginine，Arg）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、亮氨酸（leucine，Leu）、赖氨酸（lysine，Lys）和柠檬酸（citric acid，CA）对香兰素的检测并没有明显干扰，在5%容限范围以内，证明了构建的Co3O4/GR/GCE 电化学传感器选择性较好。

表2 干扰离子对Co3O4/GR/GCE 测定的香兰素影响Table 2 Effect of interfering ions on vanillin measured by Co3O4/GR/GCE

2.6 实际样品分析

准确吸取100 μL 样液在优化条件下进行DPV测定，通过加标回收实验计算回收率，其结果见表3。表中数据显示样品中的香兰素在Co3O4/GR/GCE上发生明显的电化学响应信号，三次实验的平均回收率102.4%，标准偏差为1.47%，证明Co3O4/GR/GCE构建的电化学传感器对于香兰素检测具有稳定且可靠的电催化性能。

表3 饼干中香兰素的测定（n=3）Table 3 Determination results of vanillin in cookie product (n=3)

3 结论

石墨烯高的机械强度、快速高效的传热性能及超高电导率的优势是大多材料不可比拟的，此外良好的生物兼容性使其能够与很多材料进行复合，其与金属纳米颗粒两者之间的相互协同作用极大地提升了导电性和催化性，促进了待测物和复合修饰电极表面在氧化还原过程中电子的传递和转移。因此本工作制备的Co3O4/GR/GCE 修饰电极作为香兰素的电化学传感器，实现了对待测物香兰素的快速响应，回收率和重现性结果都比较理想，并应用于实际样品中香兰素含量检测，开拓了石墨烯导电聚合物在食品添加剂中的检测范围，为香兰素的检测方法的制订提供了数据支撑。