唑吡坦抗原的合成与鉴定

袁强，梁飞敏，伍丽贤

（1.广州万孚生物技术股份有限公司，研发中心，广东 广州 510663；2.广州正孚检测有限公司 广东正孚法医毒物司法鉴定所，广东 广州 510663）

唑吡坦是一种咪唑吡啶类药物，最初作为成瘾药物苯二氮䓬的安全替代品上市。唑吡坦作为“Z类药物（Z-drugs）”的代表药物之一[1]，能够使机体产生镇静作用，是市面上常用的安眠类处方药物[2]。受现今生活节奏的加快及压力的影响，助眠类的保健食品市场不断扩大，因唑吡坦的镇静安眠效果突出，一些不法分子为达到其产品宣传效果，通过往保健食品中违法添加唑吡坦，从中获利。近年来，唑吡坦滥用致使人体中毒、精神不良，甚至死亡的案件报道逐年增加[3]。随着对唑吡坦临床的深入研究，数据表明长期使用高剂量会增加人体对唑吡坦的依赖性，造成机体对唑吡坦上瘾的风险[4]，有案例报道表明某患者过度服用唑吡坦后产生了对唑吡坦的耐受性和依赖性，并出现了意识模糊和幻觉等后遗症[5]。因此，唑吡坦的滥用严重损害人体健康，有必要建立相关检测方法加强对唑吡坦的监控。

目前关于唑吡坦的检测与监控，主要通过气相[6]或液相色谱法[7]、气相或液相色谱-质谱法联用等方法[8]。这些仪器方法选择性好、灵敏度高，但仪器设备昂贵，操作复杂，存在检测耗时较长，检测成本较高等问题，不适用于大量样品的现场即时检测。免疫检测法是通过抗原抗体反应来检测样品中滥用药物分子的方法[9]，该方法操作简单，耗时少，同时具备较好的检测灵敏度和特异性，是目前国际上通用的一种滥用药物现场检测的方法[10]。因此，研究唑吡坦半抗原的合成方法及唑吡坦免疫检测试剂对于唑吡坦的滥用快速检测非常重要。目前，关于唑吡坦半抗原设计及快速检测的方法尚未见报导，本文主要通过碳二亚胺法合成唑吡坦半抗原并制备唑吡坦（ZOL）免疫检测试剂（胶体金法）。拟为唑吡坦的滥用快速检测提供解决方案，从而服务于全球公共卫生健康事业。

1 材料与方法

1.1 仪器，试剂

1.1.1 仪器

精 密 电 子 天 平MCE 1202S-2CCN-0（Sartorius），数显加热恒温磁力搅拌器C-MAG HS7（IKA），超纯水仪Milli-Q Advantage A10（Millipore），冷却水循环器CCA-1111、旋转蒸发仪N-1001（EYELA），台式高速离心机ST16R，微量紫外-可见分光光度计NanoDrop 2000C（Thermo），干型透析袋44-14000D（北京瑞达恒辉科技发展有限公司），垂直电泳槽DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂），XYZ大平台三维感应划膜喷金仪HM3260（上海金标生物科技有限公司）。

1.1.2 试剂

唑吡坦（美国C & C公司），溴丁酸乙酯（Aladdin），牛血清蛋白（MW：67000），N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺（Sigma），鼠抗唑吡坦单克隆抗体（广州万孚生物技术股份有限公司），其他试剂均为广州化学试剂厂。

1.2 唑吡坦抗原合成

1.2.1 唑吡坦半抗原的合成

将唑吡坦 307.39 mg（1 mmol）溶于乙腈∶水（2∶1，V/V）15 mL中，用甲酸调至pH 5，在搅拌条件下，30～35 min内逐滴滴加新制2 M KMnO4水溶液12 mL，密封RT反应14 h。过滤，滤液调pH至7。用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有机相用10 g无水硫酸钠干燥12 h；有机相减压蒸干，得到化合物A（269 mg）。将上述所得化合物A加入10 mL（C2H5）3N，414.63 mg K2CO3，20 mg KI，20 mg TBAB，292.57 mg溴丁酸乙酯，在He保护下，50 ℃反应20 h；反应体系降温至室温，在搅拌条件下加入20 mL水，用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有机相用10 g无水硫酸钠干燥12 h；有机相减压蒸干，得到化合物B（202 mg）。

将上述所得化合物B加入10 mL乙醇和5 mL饱和氢氧化锂溶液，40 ℃反应4 h；反应体系降温至4 ℃左右，在剧烈搅拌条件下，5 min内滴加10 mL水；待反应体系温度维持4 ℃后，1 M盐酸调pH至3，用7 mL×3乙酸乙酯萃取，有机相用10 g无水硫酸钠干燥12 h；有机相减压蒸干，得到唑吡坦半抗原（162 mg）（4-（N-甲基-2-（6-甲基-2-（对甲苯基）咪唑[1，2-α]吡啶-3-基）乙酰胺基）丁酸）（结构如图1）。

图1 唑吡坦半抗原

1.2.2 唑吡坦抗原的合成

在25 mL干燥单口瓶中，加入1 mmol唑吡坦半抗原、1.2 mmol N-羟基琥珀酰亚胺、1.2 mmol环己基碳酰二亚胺和8 mL N，N-二甲基甲酰胺，在氦气保护下25 ℃下搅拌18 h。反应完成后，将反应混合物分装8个1.5 mL离心管中，10 000 rpm离心30 min，将上清液（活性酯溶液）分装在8个2 mL的玻璃密封瓶中氦气保护下4 ℃储藏备用。

取50 mg 牛血清蛋白溶解于8 mL 0.1 M pH7.0磷酸盐缓冲液，维持反应体系温度在4 ℃左右，将2.6 mL活性酯溶液缓慢的滴加到牛血清蛋白-磷酸盐溶液中，用0.05 M盐酸随时调整反应液的pH，维持反应体系的pH在7.0左右，维持反应体系温度4 ℃左右，搅拌反应18 h；反应结束后，反应液转入透析袋（截留分子量：14 000 D）中，用0.05 M pH7.0磷酸盐缓冲液透析多次，用微量紫外-可见分光光度计进行监测，直至透析液在260 nm和280 nm吸光值与基线一致[11]，然后将反应液冻干，得唑吡坦抗原：唑吡坦-牛血清蛋白[12]。

1.2.3 唑吡坦抗原的合成路线

图2 合成路线

通过与蛋白质偶联合成人工抗原，进而使原本无免疫原性的化学分子获得免疫原性是应用于快速检测分析的基础，因此鉴定人工抗原是否合成成功是关键。本实验通过紫外线光谱测定法，比较唑吡坦抗原与唑吡坦半抗原，BSA的紫外吸收曲线，从而证实唑吡坦抗原合成成功。再通过蛋白电泳证实唑吡坦抗原的分子量大于BSA，为唑吡坦抗原成功合成提供直接有利的证据。

1.3 唑吡坦抗原鉴定

1.3.1 紫外光谱法测定

紫外光谱法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理，分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱迭加的性质。

分别测定上述唑吡坦半抗原、牛血清蛋白、上述唑吡坦抗原在190～300 nm紫外光谱扫描结果，对照三者的紫外吸光光谱特征可以进行定性解析。检测并分析三者的在某些波长处的吸光值，可说明是否偶联成功抗原[13]。

1.3.2 蛋白质电泳测定

按《现代免疫学实验技术》[14]进行操作，唑吡坦抗原取样量10 μg。

1.3.3 活性检测

用免疫层析法对唑吡坦抗原检测。用划膜喷金仪将唑吡坦抗原固定到硝酸纤维素膜上，与胶体金标记的唑吡坦单克隆抗体，组装成胶体金免疫层析分析试纸[15]，对试纸条进行检测。

2 结果

2.1 唑吡坦半抗原的合成鉴定结果

本研究选择以唑吡坦分子结构中胺基作为连接点，衍生出丁酸手臂作为蛋白载体连接点，最大限度保留唑吡坦的分子结构特征。经质谱分析鉴定，唑吡坦半抗原合成成功[MW：378.2（M-1）]，见图3。

图3 唑吡坦抗原的ESI-MS分析图谱

2.1.1 唑吡坦人工合成抗原的紫外扫描结果

唑吡坦半抗原、牛血清蛋白（BSA）及唑吡坦抗原的紫外扫描图（如图4所示），牛血清蛋白（BSA）在279 nm和252 nm处有典型吸收，唑吡坦半抗原和唑吡坦-牛血清蛋白偶联物的吸收在279 nm和252 nm处有明显的偏移，这说明该人工抗原偶联物与唑吡坦半抗原有不同的紫外吸收特征，表明半抗原与载体蛋白偶联成功[16]。

图4 唑吡坦半抗原、牛血清蛋白及唑吡坦抗原在PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）中的紫外光谱图

2.1.2 唑吡坦合成抗原的蛋白质电泳测定结果

2、3、4泳道：唑吡坦抗原；1、5泳道：Marker（从上向下分子量依次为116 kD β-galactosidase，66.2 kD Bovine serum albumin，45 kD Ovaibumin，35 kD Lactate dehydrogenase，25 kD REase Bsp98l，18.4 kD β-lactoglobulin，14.4 kD Lysozyme）；6泳道：牛血清蛋白

图5 唑吡坦抗原蛋白质电泳

由图5可见，唑吡坦抗原平均色斑位于66 KD与116 KD之间，并高于67 KD牛血清蛋白。唑吡坦抗原分子量大于牛血清蛋白分子量，说明唑吡坦半抗原与牛血清蛋白偶联成功。

2.2 抗原活性检测

2.2.1 唑吡坦检测用胶体金免疫层析分析试纸的制备

（1）胶体金-单抗结合物玻璃纤维条的制备

将胶体金标记的唑吡坦单克隆抗体与10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合，配制成浓度0.5 mg/mL的溶液，均匀涂布在玻璃纤维素纸上，涂布量为50 μL/cm，50 ℃干燥12 h。

（2）检测线和质控线的制备

检测线（T线）：将唑吡坦抗原与0.01 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合，配制成浓度0.2 mg/mL的溶液，用划膜喷金仪固定在硝酸纤维素膜上。

质控线（C线）：将羊抗鼠IgG多抗与10 mM pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合，配制成浓度0.1 mg/mL的溶液，用划膜喷金仪固定在硝酸纤维素膜上。

然后在50 ℃干燥12 h。

（3）胶体金免疫层析分析试纸的组装

将滤样纸、包被有胶体金标记唑吡坦抗体的玻璃纤维素纸、包被有检测线（T线）和质控线（C线）的硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接组装成测试条，将测试条置于支撑板上，用胶固定，如图6。

图6 胶体金免疫层析分析试纸

2.2.2 唑吡坦检测用胶体金免疫层析分析试纸的测试

（1）样本配制

根据测试要求，在空白尿样中添加唑吡坦标准品，分别配制成含唑吡坦的样本，浓度为0 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、55 ng/mL、60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL和75 ng/mL。

（2）检测与结果

将上述系列浓度定量梯度测试，灵敏度实验结果如表1。

表1 胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度试验结果

实验结果表示，该试纸最低检测量50 ng/mL。

（3）阴性样本

根据测试要求，对经过GC/MS分析测试后的临床阴性样本308例，分别加样在唑吡坦检测用胶体金免疫层析分析试纸上，结果均为阴性。综上证明，唑吡坦抗原能与抗体匹配结合，由此证明合成的人工抗原具有抗原活性。

3 讨论

唑吡坦，属于非苯二氮䓬类催眠药，其药理是通过调节机体内的GABAa受体氯通道，从而具有抗惊厥、抗焦虑和轻微的肌松弛作用，主要用于失眠患者的短期治疗[17]。唑吡坦最初被认为是一种比苯二氮䓬类更安全的药物[18]，但越来越多的研究证明唑吡坦具有使机体耐受成瘾的风险[19]。同时，因滥用唑吡坦导致的精神疾病不断被报道，后续戒断也给医护人员和患者带来困难。早在2001年，WHO已经将唑吡坦列为与苯二氮䓬类同等依赖风险类别[20]，作为一种容易被滥用药物，快速检测唑吡坦滥用有助于世界公共卫生健康事业。

与液相-质谱仪等大型分析仪器相比，基于抗原-抗体特异性结合原理的免疫检测方法具有操作简单、成本低、高通量及灵敏准确的优点，适合应用于多种环境下的药物滥用的筛查[21]，帮助临床医生在病人床边更快地获得检测结果[22]。然而，关于唑吡坦半抗原设计及快速检测的方法尚未见报导，有必要研究与建立唑吡坦的快速免疫检测方法。因唑吡坦分子量为307.39，分子量低于1 000的化合物不具有免疫原性，需对其分子结构进行一定的修饰改造，才能诱导机体产生相对应的抗体。唑吡坦分子结构中存在有苯环、羰基、胺基等可以进行结构修饰的基团，通过前期研究[23]，发现苯环和羰基修饰后，导致唑吡坦的分子空间结构存在较大改变，不利于得到与特异性高的人工抗原。因此，本研究选择以胺基作为连接点，引入具有羧基的活性手臂，再与载体偶联制备成人工抗原得到唑吡坦的人工抗原。在小分子滥用药物的免疫分析中，能否合成稳定且具有良好免疫原性的人工抗原分子是制备抗体和建立免疫分析方法的最关键的步骤，需要对人工抗原进行抗原活性检测。本实验表明，大于50 ng/ml的人工合成抗原可以与之匹配的抗体发生免疫反应，从而可以证实唑吡坦人工合成抗原能够有效刺激免疫应答反应的产生，具有抗原活性，为下一步开发免疫检测产品提供了理论基础。

4 总结

本研究成功合成了唑吡坦半抗原及其人工抗原，该抗原具有较高的活性，且与唑吡坦抗体反应表现出较高的特异性，为研究开发特异性强、灵敏度高、方便快捷的免疫检测产品提供了方向性。但本实验尚未设置干扰实验来验证唑吡坦人工合成抗原的抗干扰性；且对于一款可上市的胶体金检测产品而言，需要通过人体临床试验来研究其特异性、灵敏度、稳定性及临床可报告范围等性能指标。本实验下一步将进行人体临床试验，从而进一步验证在实际应用中该唑吡坦合成抗原的可靠性。