咖啡因在帕金森病小鼠模型中神经保护作用的转录组学分析

郑余银，冯艺佳，阮青青，屠文展

1.温州医科大学附属第二医院 康复医学科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属第一医院 神经内科，浙江 温州 325015

帕金森病（Parkinson"s disease，PD）是世界上第二大神经退行性疾病，其主要临床表征为静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓，部分患者伴有焦虑、抑郁、记忆减退等精神类障碍[1]。左旋多巴胺药物被广泛应用于PD患者治疗中，但该药物对静止性震颤无效，且会造成肠胃不适、恶心等不良反应，同时，长期服用左旋多巴胺的PD患者表现出对药物不敏感，且伴随易动症[2-4]。因此，寻找新的用于缓解或治疗PD的药物具有重要的临床和社会价值。咖啡因是咖啡的主要活性成分之一，大量的流行病学调查表明长期饮用咖啡可有效延缓PD的病理进程[5-7]。LUAN等[8]通过动物实验发现，长期饮用咖啡因可有效减轻小鼠纹状体由α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）聚集引起的细胞凋亡及炎症反应，但咖啡因在PD病理进程中的保护机制尚不明确。本研究通过在小鼠海马脑区注射α-Syn纤维体，模拟α-Syn在海马脑区累积而引起的认知功能障碍，利用转录组学分析探讨咖啡因缓解α-Syn造成认知功能受损的可能分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：10周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量22～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0011。饲养环境为（23±2）℃，12 h/12 h光照/暗周期。所有实验动物操作规范均按照温州医科大学实验动物管理规定进行。

1.1.2 试剂和仪器：α-Syn纤维体（No.SPR-317）购自加拿大StressMarq公司；咖啡因（Cat#C0750）和戊巴比妥钠购自美国Sigma公司；DAB试剂盒（abs957）购自上海Absin公司；α-Syn抗体（ab209538）购自英国Abcam公司；RNA提取试剂TRIzolTM（15596026）购自美国Thermo Fisher公司；cDNA反转录合成试剂盒（RR037A）购自日本Takara公司；SYBR Green试剂购自美国BIO-RAD公司；光学显微镜DFC7000 T购自德国Leica公司；脑立体定位仪（68507）购自深圳瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 α-Syn诱导的PD动物模型的建立：按照HU等[9]的方法，利用脑立体定位注射技术，将5 μg（溶于3 μL PBS溶液）α-Syn纤维体或同等体积的无菌PBS注射到10周龄雄性小鼠双侧海马区（坐标：AP，-2.2 mm；ML，±1.5 mm；DV，-2.3 mm）。

1.2.2 分组与处理：根据LUAN等[8]的方法，将咖啡因溶于饮用水中（1 g/L）。实验分为3组：PBS造模饮水组（PBS组，n=10），α-Syn造模饮水组（α-Syn组，n=9）和α-Syn造模咖啡因处理组（α-Syn-Caff组，n=10）。α-Syn造模后，连续3个月每天给予实验小鼠咖啡因或水饮用。

1.2.3 α-Syn免疫组织化学染色：用二氨基联苯胺法（DAB）进行α-Syn染色。α-Syn造模3个月后，每组3只小鼠进行深度麻醉（0.3%戊巴比妥钠）；PBS及PFA灌注后取脑组织进行石蜡包埋并制备切片（30 μm）；脑片经2 h烘烤（55～60 ℃）、梯度乙醇水化、抗原修复后，滴加3% H2O2，室温孵育10 min，PBS洗3次；5%羊血清封闭30 min后，滴加α-Syn抗体，4 ℃过夜；PBS洗3次，用DAB试剂显色后，进行苏木素复染、脱水、二甲苯透明及封片，显微镜下进行观察拍摄。

1.2.4 Y迷宫实验：Y迷宫实验用于检测小鼠的工作记忆，将实验小鼠放置于Y迷宫的A臂，记录5 min内小鼠在Y迷宫中的进臂顺序。如：A-B-C，AC-B记为正确顺序，A-B-A或A-C-A记为错误顺序。统计正确率来评估小鼠的工作记忆能力[10]。

1.2.5 转录组测序分析：Y迷宫实验后，小鼠麻醉（0.3%戊巴比妥钠）并用PBS灌注后，于冰板上迅速分离海马组织，液氮速冻后-80 ℃保存。利用TRIzol法提取总RNA，A260/280=1.9～2.0符合建库要求，并送至北京诺禾致源技术有限公司进行转录组测序及后续生物信息学分析[差异基因筛选标准：log2（fold change）＞1.3]。

1.2.6 荧光定量PCR（qPCR）：对应样本的RNA（1 μg）经反转录合成cDNA。利用SYBR-Green法进行荧光定量，检测目的基因的转录表达水平。各基因qPCR的引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 统计学处理方法 采用Graphpad 5.0软件进行分析。计量资料采用±s表示，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 长期饮用咖啡因有效改善α-Syn引起的工作记忆障碍 DAB染色观察α-Syn的聚集情况。α-Syn蛋白在造模饮水组小鼠海马脑区有明显聚集，呈胞体样结构，证明造模成功。相较于α-Syn组，α-Syn-Caff组小鼠的α-Syn聚集明显较少，见图1A。Y迷宫实验结果发现，相较于PBS组小鼠，α-Syn造模后，小鼠在Y迷宫中的进臂顺序正确率明显下降（P＜0.05），表明其工作记忆表现能力受损；而α-Syn-Caff组相较于α-Syn组，其工作记忆能力有显著改善（P＜0.05），见图1B。

图1 咖啡因改善α-Syn诱导的工作记忆障碍

图2 α-Syn蛋白引起海马脑区小胶质细胞活化

2.2 α-Syn蛋白促进海马脑区小胶质细胞的活化 通过转录组分析发现：相对于PBS组，α-Syn组在转录水平上有431个基因显著上调（P＜0.05），232个基因下调（P＜0.05），见图2A。经KEGG聚类分析后发现：差异基因主要集中在破骨细胞分化、细胞内吞及趋化反应等信号通路，见图2B。在α-Syn组的转录表达谱中，Tmemll9和Cx3crl表达水平显著升高（P＜0.05），随后用qPCR验证了这一结论；此外，Trl9在α-Syn组也呈现高表达（P＜0.05），见图2C。

2.3 长期饮用咖啡因增强神经元和胶质细胞的增殖能力 在对α-Syn组和α-Syn-Caff组进行转录组差异基因分析，发现有363个基因上调（P＜0.05），277个基因下调（P＜0.05），见图3A。我们对这些差异基因进行KEGG聚类发现：只有趋化因子信号显著上调（P＜0.05），这说明咖啡因可能增强了对病变周围免疫细胞的招募，对损伤组织进行修复（见图3B）。但是，咖啡因对α-Syn引起的小胶质细胞分化、内吞作用及免疫调节均无显著改善。因此，我们对差异基因进行GO注释分析，结果发现：相对于α-Syn组，α-Syn-Caff组富集的功能注释主要集中在细胞增殖（包括干细胞、神经前体细胞和胶质细胞）和调节突触传递方面，见图3C。我们对参与细胞增殖的关键基因Sox2和VEGFA进行了qPCR验证，发现咖啡因饮用可以显著诱导Sox2和VEGFA转录表达（P＜0.05），见图3D。

3 讨论

研究表明α-Syn纤维体被神经元吸收，诱导正常的内源性α-Syn向其聚集，从而形成包涵体并在大脑中呈现朊病毒样扩散。异常聚集的α-Syn可通过氧化应激、细胞毒性等方式造成神经元的损失[11-12]。LUK等[13]在脑区注射α-Syn纤维体模拟PD的认知障碍和运动障碍。本研究选择海马注射α-Syn纤维体模拟PD的病理特征及认知功能缺陷表型，来探讨咖啡因的认知功能保护作用机制。

图3 长期饮用咖啡因有效增强细胞增殖能力

部分PD患者在运动症状之前就表现出明显的认知功能障碍，这可能与α-Syn在脑内的扩散方式有关。当α-Syn扩散并异常聚集在参与认知的脑区或神经元时，伴随着神经元的退行性病变，认知能力会逐渐下降。在模型中，在海马神经元注射α-Syn 3个月后，α-Syn蛋白在该脑区大量聚集，小鼠表现出明显的认知缺陷；而饮用咖啡因后α-Syn的聚集大量减少，且有效缓解其造成的工作记忆能力损伤。这一结论与LUAN等[8]和HU等[9]在纹状体脑区注射α-Syn并给予咖啡因处理的结果相一致，进一步证明了咖啡因对PD认知功能的保护作用。

在中枢神经系统中，小胶质细胞的活化，尤其是促炎M1型的分化是PD病理的主要变化之一。一直以来，关于α-Syn促进小胶质细胞活化的分子机制是PD的研究热点之一。小胶质细胞的激活及促炎因子的释放一直被认为是神经退行性病变的共同病理表现。大多数观点认为：小胶质细胞的活化是由于α-Syn、Aβ或Tau蛋白等异常聚集引起的[14-16]。有研究指出α-Syn可通过与小胶质细胞表面的TLR受体相互作用来激活胶质细胞[17]。近期的多巴胺神经元移植实验表明，α-Syn引起的小胶质细胞活化可能参与了PD病理的发生发展，小胶质细胞在α-Syn病理性聚集及传播中发挥了重要的作用[18]。Tmem119是小胶质细胞活化的标志物，在活化的小胶质细胞中高表达[19]。本研究发现咖啡因饮用可有效降低Tmem119的转录水平（P＜0.05）。这暗示着咖啡因可有效减轻α-Syn引起的小胶质细胞活化及炎症反应。随着对Tmem119操控技术的发展[20]，抑制Tmem119可能是潜在的有效缓解PD的治疗策略。

ALE-AGHA等[21]研究发现，在皮肤受到紫外线损伤时，咖啡因会促进细胞的DNA修复；咖啡因还可以促进p27蛋白（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B）向线粒体的转运，从而增强心脏细胞的抗损伤能力。另有研究发现，给予小鼠适量的咖啡因，可促使衰老小鼠的心肌功能得到极大改善，同时加快心肌受损后的修复[22]。在转录组分析中发现，咖啡因的主要功能也是富集在促细胞增殖信号通路。这说明在PD的病理进程中，咖啡因的保护作用可能正是增强了神经元及其他类型细胞的修复及增殖能力来对抗α-Syn的损伤作用。

本研究通过转录组分析发现咖啡因可有效改善海马脑区的小胶质细胞的炎症反应，增强细胞的增殖能力，并改善小鼠的认知功能障碍，为阐明咖啡因对PD的保护机制提供了新证据。