芽球菊苣根粗多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性和相对分子量分析

薛 山，巩子童，林靖娟，郑舒晨

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000；2.菌物产业福建省高校工程研究中心，福建漳州 363000）

菊苣（Cichorium intybusL.）是一种菊科菊苣属多年生草本植物，其地上部分与根部已作为药材收载于《中国药典》2015版（一部）[1]。菊苣广泛分布于我国的西北、华北、东北等地，其中新疆南部是最为主产的区域，都是维吾尔族与蒙古族常用的药材。芽球菊苣（Cichorium intybusL.var.foliosumHegi）是菊苣属菊苣中驯化选育出来的一个变种，原产于地中海、亚洲中北部和北非，现已在我国以及欧洲广泛种植。研究显示菊苣根富含多糖（菊糖[2-3]、糊精和淀粉[4]）、生物碱、萜烯[5-7]、多酚[8]、VD类似物[9]等多种生物学活性化学成分，尤其是菊苣多糖已在降血糖、降血脂、抗氧化[10-11]、保肝护肝[12-13]、提升免疫力[14-15]等功效方面都显示出了较高的活性。可见，菊苣多糖的开发与应用也已成为食品科学、生物医药等领域的重要研究方向。

近年来，包括菊苣在内的植物多糖提取已有热水浸提、酸法、碱法、酶法、膜分离法、超临界CO2萃取等方法，但是酸法与碱法容易造成糖苷键断裂，酶法对于温度、pH都有较高的要求，超滤膜过滤法对于多糖分子质量的掌握有较高的要求，超临界CO2萃取对仪器设备的要求较高[16]。在这些方法中，传统的热水浸提法得率虽然不是最高的，但是操作最便捷，对仪器设备要求不高，对环境污染较小，是一种非常经典的提取方法[17]。然而，对于菊苣多糖的提取优化基本都是正交[17]或响应面法[16]，得到的是确定的工艺参数，而尚未有Box-Behnken结合Matlab分析法在菊苣多糖提取中的应用。Matlab是国际上最优秀的科技应用软件之一，具有强大的科学计算功能，并提供了专门的优化工具箱，通过建立研究问题的数学模型，编写程序代码，有效计算出最优解，广泛应用于各研究领域[18]，如化工油脂提取优化[19]。Box-Behnken结合Matlab分析法不仅可以得到确切的菊苣根多糖提取工艺参数及影响因素三维交互效果图，还可以得到最优的参数范围和四维交互效果图。

基于此，本研究采用Box-Behnken Design结合Matlab分析法对菊苣根粗多糖进行提取优化，对其体外羟自由基清除能力和还原力进行了测定，采用HPLC分析所提多糖纯化后中性糖与酸性糖平均相对分子量，以期为菊苣多糖工业化提取应用及其产品的研发推广提供理论依据与创新动力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芽球菊苣根干品 原产于印度，由大闽食品（漳州）有限公司提供；无水乙醇、苯酚、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、无水葡萄糖，盐酸、浓硫酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钠、三羟甲基氨基甲烷均为分析纯，西陇科学股份有限公司；SephadexG-150葡萄糖凝胶 瑞典Pharmacia公司。

DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；Forma -86 ℃超低温冰箱美国UNICO；ALPHA 1-2LD PLUS真空冷冻干燥机 美国CHRIST公司；Vivaflow 200vivascience超滤膜 美国Sartorius公司；easy-loadⅡ蠕动泵Bamant公司；TGL-20M台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV5100B紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；RHB-32ATC手持折光仪 上海光学仪器厂；1200液相色谱仪 美国安捷伦。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将菊苣根干品放入60 ℃烘箱干燥至水分含量5%以下，中药粉碎机粉碎后过60目筛，密封避光保存备用。

1.2.2 菊苣根粗多糖的提取工艺 称取5.00 g菊苣根粉末，置于250 mL的三角瓶中，加入100 mL蒸馏水，70 ℃水浴提取150 min，离心取上清液，将滤液减压浓缩至约20 mL（大约），置于烧杯中冷却至室温，向浓缩液中缓慢地滴加无水乙醇80 mL并快速搅拌，4 ℃静置冷藏12 h，弃去滤液，再次加入少量蒸馏水超声溶解，减压浓缩至质量浓度为1.1～1.2 g/mL，置于烧杯中冷却至室温。预冻之后再真空冷冻干燥（-50 ℃，真空度＜15 Pa，干燥24 h）。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同液料比对菊苣根粗多糖得率的影响固定提取温度为70 ℃，提取时间150 min。考察不同料液比：1:100、3:100、5:100、7:100、9:100 g/mL对菊苣根粗多糖得率的影响。

1.2.3.2 水浴温度对菊苣根粗多糖得率的影响 固定化料液比为3:100 g/mL，提取时间150 min。考察不同水浴温度：50、60、70、80、90 ℃对菊苣根粗多糖得率的影响。

1.2.3.3 水浴时间对菊苣根粗多糖得率的影响 固定料液比为3:100 g/mL，提取温度70 ℃。考察不同水浴时间：90、120、150、180、210 min对菊苣根粗多糖得率的影响。

1.2.3.4 提取次数对菊苣根粗多糖得率的影响 固定料液比为3:100 g/mL，提取温度70 ℃，提取时间150 min。考察提取1次、2次、3次对菊苣根粗多糖得率的影响。

1.2.4 Box-Benhnken试验设计 以单因素试验为基础，设计3因素3水平的Box-Benhnken响应面试验，见表1。

表1 Box-Benhnken试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 Matlab分析及验证试验 利用Matlab软件，采用优化计算方法以及算法语言的图形处理功能，通过编制程序M（程序代码），计算出料液比（A）、水浴温度（B）、水浴作用时间（C）对菊苣根粗多糖得率（y）的四维及三维交互影响结果。在最优组合工艺条件下进行验证试验。

1.2.6 菊苣根粗多糖得率的测定

1.2.6.1 菊苣根总糖的测定 采用苯酚-硫酸法测定菊苣根总糖含量。首先，绘制葡萄糖标准曲线：分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的1 mg/mL葡萄糖工作液，以蒸馏水补至2 mL，加入8%苯酚溶液1.0 mL，充分摇匀，再从试管液正面快速加入浓硫酸5 mL，立即充分摇匀，在室温下静置20 min后于490 nm波长下比色测定其吸光值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并求得标准线性方程为：y=0.0079x+0.0243，R2=0.992。

菊苣根总糖含量的测定：取75 mg菊苣根粗多糖于250 mL容量瓶中，加水至刻度，吸取1 mL样液，按上述操作步骤，测定其吸光值，根据标准曲线计算总糖含量。

1.2.6.2 菊苣根还原糖含量的测定 采用DNS试剂法测定菊苣根还原糖含量。首先，绘制葡萄糖标准曲线：分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准葡萄糖工作液，加蒸馏水补至1 mL，加入1 mL DNS试剂，沸水浴中加热5 min，取出以自来水冷却，再加入蒸馏水8 mL，充分摇匀，在520 nm波长下比色测定吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线，并求得标准线性方程为：y=0.0262x-0.0437，R2=0.999。

菊苣根还原糖含量的测定：取250 mg菊苣根粗多糖于250 mL容量瓶中，加入蒸馏水至刻度，吸取1 mL样液，按上述操作步骤，测定其吸光值，根据标准曲线计算还原糖含量。

1.2.6.3 菊苣根粗多糖得率的测定 菊苣根含有单糖（还原糖）、低聚糖（多为还原糖）和多糖（非还原糖），故菊苣根粗多糖的含量以总糖含量与还原糖含量的差值表示。菊苣根粗多糖的得率以下式计算[20]：

式中：H为粗多糖的重量（g），T为多糖含量（%），W为菊苣根粉末重量（g）。

1.2.7 菊苣根粗多糖体外抗氧化性测定

1.2.7.1 羟自由基清除率测定 取3 mg/mL的粗多糖溶液（1、2、3、5、7、9、10 mL）于试管中，加入适量水(反应液总体积为15 mL)，然后各管分别加入1 mL的硫酸亚铁（6 mmol/L）和1 mL水杨酸（6 mmol/L），摇匀后各管加入1 mL的H2O2（6 mmol/L）混匀，37 ℃水浴15 min，以蒸馏水为空白对照，以VC为阳性对照，在510 nm波长下测定各反应溶液的吸光度并计算自由基清除率。

式中：A0为空白对照的吸光值，AX为加样品的吸光值，AX0为不加显色剂H2O2。

1.2.7.2 还原力的测定 参考Lee等[21]方法修改。方法向每支试管中依次加入1.0 mL不同浓度的粗多糖溶液（0.5～3.0 mg/mL）、2.5 mL磷酸缓冲液（pH 6.6，0.2 mol/L）以及2.5 mL质量分数1%的铁氰化钾（K3Fe（CN）6L），于50 ℃水浴中反应20 min后迅速冷却，并加入2.5 mL质量分数10%的三氯乙酸（TCA）溶液，以3000 r/min离心10 min后取上清液2.0 mL，并加入2.0 mL蒸馏水和0.4 mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀，于10 min后测定波长700 nm处的吸光值A1。用蒸馏水替代样品液测得吸光值记为A0。反应物的吸光度越大其还原力越强。再以VC为阳性对照，实验重复三次。

还原力=A1-A0

式中：A0为空白对照的吸光值，A1为加样品的吸光值。

1.2.8 HPLC检测菊苣根中性糖和酸性糖相对分子量

1.2.8.1 菊苣根粗多糖的分离纯化 参考李婷婷等[22]方法略微修改：将处理好的SephadexG-150葡萄糖凝胶缓慢绕壁注入层析柱中，为了防止产生分层以及气泡，装到一定高度即可。装柱后，用0.02 mol/L pH 7.20 Tris-HCl动态平衡4倍体积（约3000 mL）后，配制100 mg/mL菊苣根粗多糖上样，等待样品完全进入界面，用0.02 mol/L pH7.20 Tris-HCl 溶液进行洗脱，控制流速为0.1 mL/min，洗脱至无糖下来即苯酚硫酸法测定值无显色，收集洗脱的液体为中性糖部分。后用0.03～0.1 mol/L氯化钠溶液进行洗脱，收集到的洗脱液为酸性糖。将收集到的中性糖和酸性糖洗脱液进行超滤、真空冷冻干燥后得到中性糖和酸性糖。

1.2.8.2 相对分子量测定 HPLC测定右旋糖酐标准品Mw50000、25000、12000、5000和1000 Da 的色谱峰保留时间t，以保留时间t对标准样品Mw的对数值绘制标准曲线，采用二次方程拟合得其方程为：lgMw=-2.405+1.827T-0.113T2。依据菊糖的保留时间计算其相对分子量。

HPLC 的条件：仪器Agient 1200；色谱柱（Shodex OHpak SB-804HQ）；柱温30 ℃；流动相为超纯水；流速0.6 mL/min；检测器示差检测器Agient 1260[22]。

1.3 数据处理

所有数据均用3次平行实验的平均值表示，利用SPSS Statistics 24.0统计软件对试验数据进行单因素显著性分析，P＜0.05表示结果显著，标示为不同字母。采用Origin8.1软件作图分析结果。利用Matlab （MATrixLABoratory）软件进行交互试验数据计算及四维、三维绘图。按照Matlab实验所得的最佳工艺参数进行菊苣粗根多糖的提取，对实验结果进行验证。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对菊苣根粗多糖得率的影响 如图1所示，在料液比1:100～9:100 g/mL范围内，菊苣根粗多糖的得率呈现先升高后下降的趋势（P＜0.05），当料液比为3:100 g/mL时，得率有最大值。该结果与许芳等[16]研究基本一致，表明一定程度增加料液比，有利于水溶性菊苣根多糖的溶出，但是进一步升高会引起得率下降。推测原因，可能是由于过高的料液比会导致包括还原糖在内的水溶性成分大量溶出，从而导致粗多糖得率下降。

2.1.2 水浴温度对菊苣根粗多糖得率的影响 如图2所示，随着水浴温度的升高，菊苣根粗多糖的得率先升高后降低（P＜0.05），在70 ℃时取得最大值。推测原因可能是低温时分子扩散能力小，使超声空化作用不完全，但温度过高之后，部分多糖分子结构破坏、以及其他非多糖组分过多溶出，从而导致得率呈现下降趋势[23]。

图1 料液比对菊苣根粗多糖得率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yieldof crude polysaccharide from chicory root

图2 水浴温度对菊苣根粗多糖得率的影响Fig.2 Effect of water bath temperature on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.1.3 水浴时间对菊苣根粗多糖得率的影响 如图3所示，菊苣根粗多糖的得率在90～150 min范围内随着水浴时间的延长而增大（P＜0.05），在150～210 min范围内逐渐降低。推测该现象产生的原因，一是加热时间过长，部分多糖发生了热降解，二是长时间的加热导致非多糖成分的大量溶出，比如单糖和低聚糖成分。当水浴150～180 min时，粗多糖的得率能够取得较高值，鉴于水浴150和180 min条件下多糖得率差异不显著，故选择水浴时间150 min。

图3 水浴时间对菊苣根粗多糖得率的影响Fig.3 Effect of water bath time on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.1.4 提取次数对菊苣根粗多糖得率的影响 如图4所示，随着提取次数的增加，菊苣根粗多糖得率逐渐升高，其中，第2次得率显著高于第1次（P＜0.05），但第2次与第3次差异不显著，故选择提取次数2次。

图4 提取次数对菊苣根粗多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction times on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.2 Box-Benhnken优化结果

2.2.1 Box-Benhnken响应面模型的建立 在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken Design原理，以菊苣根粗多糖得率（%）为指标，选择料液比（g/mL）、水浴温度（℃）、水浴时间（min）作为考察因素，试验结果和方差分析分别见表2和表3。

表2 Box-Benhnken响应面优化实验设计及结果Table 2 Design and result of response surface optimization of Box-Benhnken

采用Design-expert8.0软件对表中数据进行分析，得到料液比（A）、水浴温度（B）、水浴时间（C）的回归方程模型如下：

2.2.2 Box-Benhnken响应模型的显著性检验 对回归模型进行方差分析，对模型系数进行显著性检验，结果见表3。方程可靠性由R2表示，其统计学上的显著性由F值检验，影响因素的显著性由模型系数的P值检验。由表3可知：模型P=0.0001＜0.01（极显著），失拟项P=0.0534＞0.05（不显著），表明该回归方程对试验的拟合度高，误差小。可以用该方程对不同条件下的提取效果进行分析、预测。通过F值可以得出，各因素对菊苣根粗多糖得率都有极显著的影响（P＜0.01），且显著性大小顺序为：料液比（A）＞水浴温度（B）＞水浴时间（C）。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis result

分析回归方程的可信度，R2值越接近1，说明回归方程越可靠，表明该回归方程可以描述该试验各因素与响应值的关系。回归方程决定系数R2为0.9947，说明回归方程的可靠性较高。R2Adj值为0.9879表明回归方程校正后可以解释98.79%响应值的变化。得率方程信噪比Adeq Precision为45.113，说明该模型可用于预测。C.V.值为0.87，反映的是回归方程的置信度，值越小，说明回归方程的置信度越高。综上，回归方程具有较高的可信度。

2.2.3 Box-Benhnken响应面最优工艺预测及验证根据Box-Benhnken响应面试验结果分析，得到最佳工艺参数的理论预测值为：料液比2.74:100 g/mL、水浴温度72 ℃和水浴时间165 min，此时菊苣根粗多糖得率的理论值为40.32%，按照该工艺条件进行3组平行实验对其进行验证，实际值为39.99%±0.43%，与预测值差异不显著（P＞0.05）。

2.3 Matlab分析最佳工艺区间

通过编程，得到料液比（g/mL），水浴温度（℃）和水浴时间（min）对菊苣根粗多糖得率影响的四维效果图（图5）。当粗多糖得率（Y）取得理论最大值（40.3164%）时，通过矩阵计算得到料液比2.7347:100 g/mL，水浴温度71.9388 ℃，水浴时间165 min。

为了更好的描述分析数据间的交互影响，分别绘制当水浴时间短（135 min）、中（150 min）、长（165 min）时，料液比与水浴温度对粗多糖得率交互影响的三维旋转曲面与等高线投影图（图6）。

图5 四维交互曲面Fig.5 4-D interactive surface

当水浴时间取下限值（C=135 min）时，固定水浴温度（B），随着料液比（A）的升高，粗多糖得率呈现逐渐升高的趋势；固定A值，随着B的升高，得率先升高后降低。此时，得率的取值范围为27.5239%～39.9341%，当A取3:100～4:100 g/mL，B取66～72 ℃区间时，得率能够取得最大值。当水浴时间取中间值（C=150 min）时，交互影响与C=135 ℃时较为类似。固定B值，随着A值增大，得率先增大后减小，固定A值，随着B值的增大，得率也呈现先升高后下降的变化趋势。此时，得率的取值范围为28.3738%～38.7017%，当A取2.7:100～3.6:100 g/mL，B取66～73 ℃区间时，得率能够取得最大值。当水浴时间取上限值（C=165 min）时，得率的变化趋势与C=135 min和C=150 min时也较为类似。此时，得率取值范围为31.1117%～40.3164%。当A取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴温度70～74 ℃时，得率能够取得最大值（约40.32%）。

综上所述，当提取时间取较高值（C=165 min），A取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴温度70～74 ℃时，菊苣根粗多糖得率可以取得较高理论值，与2.2.3中最佳工艺参数结果一致。Chikkerur等[24]采用热水浸提法提取菊苣根粗多糖，得率大约为42%，与本文结果类似，同时研究显示，烟曲霉内毒素酶进一步酶解菊苣根中提取的多酚，可将其转化为富含蔗果二糖和蔗果三糖等具有益生元作用的短链低聚果糖（SCFOS），这可以作为进一步的研究方向。

图6 水浴温度和料液比交互作用对粗多糖得率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface plots and contour plots of the effects of the interaction of various factors on extraction yield of crude polysaccharide from chicory root

2.4 菊苣根粗多糖体外抗氧化性结果分析

2.4.1 菊苣根粗多糖清除羟自由基能力的测定 菊苣根多糖及阳性对照VC对羟自由基的清除作用如图7A、7B所示。在0.25～2.50 mg/mL 范围内，菊苣根粗多糖随着浓度的增大，体外羟自由基清除率显著升高（P＜0.05），其IC50值为1.36 mg/mL，阳性对照VC在0.04～0.052 mg/mL范围内羟自由基清除率显著升高，于0.44 mg/mL达到高点，其IC50值为0.013 mg/mL。可见菊苣根粗多糖具有明显的羟自由基清除能力，但显著低于VC的羟自由基清除力（P＜0.05）。诸多学者也证实了菊苣多糖的抗氧化活性，如付爱叶等[25]报道，湖北产菊苣多糖在0.1～2.4 mg/mL范围内表现出明显的羟自由基清除活性，且与多糖浓度呈正相关；张宏志等[26]热水浸提法提得菊芋菊糖在0～15.0 mg/mL有着较高的抗氧化活性，并且在热水浸提之前采用辅助酶法、超声和微波处理能够提升多糖的抗氧化活性，这为菊苣多糖抗氧化能力的提升提供了思路。

图7 菊苣根粗多糖（A）和VC（B）对羟自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of crude polysaccharides from chicory root (A) and VC (B) on hydroxyl free radicals

2.4.2 菊苣根粗多糖还原力的测定 多糖还原力机理主要为样品中的还原酮通过电子给予能力，阻止自由基链形成，从而发挥抗氧化活性作用[27]。由图8可知，在0.1～3 mg/mL范围内，随着菊苣根粗多糖溶液浓度的升高，还原力也显著升高（P＜0.05），在相同浓度下，VC的吸光值范围为1.35～1.99。故菊苣根粗多糖具备一定的还原力，但也显著低于VC（P＜0.05）。付爱叶等[25]研究也证实了菊苣根具有还原力活性，且呈现浓度效应关系。

图8 菊苣根粗多糖与VC对Fe3+的还原力Fig.8 Fe3+ reductive ability of crude polysaccharide from chicory root and VC

2.5 菊苣根中性糖和酸性糖相对分子量

由图9和图10可知，菊苣中性糖和酸性糖均呈一个单峰，且峰尖而窄，说明菊苣中性糖和菊苣酸性糖纯度较高，其中酸性糖纯度高于中性糖。在本实验条件下，由样品的保留时间11.024和11.849 min，代入方程求得菊苣中性糖的平均相对分子量MW为10072.07 Da，菊苣酸性糖的平均相对分子量MW为2388.13 Da。研究显示，不同多糖提取方法（热水浸提、酶法、超声和微波辅助热水浸提）对菊糖的得率、聚合度、分子组成以及抗氧化能力都有显著的影响[26]，因此，不同提取条件对菊苣根粗多糖分子组成及构效关系的影响也将是日后深入探讨的方向。

图9 菊苣根中性糖的HPLC谱图Fig.9 HPLC spectrum of neutral sugarfromchicory root

图10 菊苣酸性糖的HPLC谱图Fig.10 HPLC spectra of acidic sugar fromchicory root

3 结论

采用Box-Behnken优化法结合Matlab分析法对芽球菊苣根粗多糖进行热水浸提法提取工艺优化、体外抗氧化性测定以及中性糖、酸性糖相对分子量测定。最优提取工艺参数：料液比2.74:100 g/mL，水浴温度72 ℃和水浴时间165 min，此时菊苣根粗多糖得率的理论预测值为40.32%，经验证实际值为39.99%±0.43%；Matlab分析最佳工艺取值范围：当提取时间取较高值（C=165 min），料液比取2.4:100～3.1:100 mL/g，水浴温度70～74 ℃，粗多糖得率可以取得较高得率。所提菊苣根粗多糖具备羟自由基清除能力及还原力，与浓度呈现正相关。HPLC测得菊苣根中性糖和酸性糖平均相对分子量分别为10072.07 和2388.13 Da。本研究不仅确定了菊苣根粗多糖的最佳提取工艺条件参数与波动范围，还确定了所提多糖的体外抗氧化活性以及中性、酸性多糖分子量分布，为菊苣根多糖的工业化生产及其产品的研发利用提供了理论依据与创新思路。