益生菌植物乳杆菌G1-28复合冻干发酵剂制备及保藏条件研究

李大鹏，高玉荣

（巢湖学院化学与材料工程学院，安徽合肥 238000）

益生菌是一类有益于机体的活性微生物，摄入一定量的活性益生菌有助于调节宿主肠道的微生态平衡，从而有益于宿主健康[1]。植物乳杆菌是目前被广泛关注的益生菌，普遍存在于果蔬的表面，具有很强的发酵产酸能力[2]。同时研究表明植物乳杆菌具有较强的耐受人体胃肠道内不良环境的能力，容易定植在人体肠道中生长代谢产生乳酸等成分，竞争性抑制肠道内有害微生物，从而有助于防治肠道疾病[3]。益生菌经培养后制备的液体菌剂，存在运输成本高、菌体失活速度快等缺点，制备易于保存的益生菌粉末状制剂已成为目前国内外研究的热点[4]。

真空冷冻干燥，也称升华干燥，是将原材料冷冻后在真空下使冰升华而使物料干燥的方法[5]。通过在微生物菌悬液中添加保护剂，可减少真空冷冻干燥过程中对菌体的伤害[6]。研究表明，采用真空冷冻干燥进行菌体的保藏，具有细胞存活率高，保藏时间长的特点，已成为菌体干粉制备最常用的方法之一[7]。由于冻干过程中使用的保护剂的类型及其作用原理不同，对于菌体的冻干过程，保护剂的选择及其复配是研究的重点内容[8]。蒋文鑫等[9]研究了不同分子质量糖（醇）类及蛋白类保护剂对短双歧杆菌冻干存活率的影响，结果表明山梨糖醇、棉子糖与胶原蛋白以质量比3:3:2时保护效果最好，短双歧杆菌的冻干存活率可达80%。牛春华等[10]研究了嗜酸乳杆菌冻干保护剂，结果表明可溶性淀粉18%，低聚木糖12%，谷氨酸钠7%，菊糖15%时，嗜酸乳杆菌细胞存活率最高可达87.4%。王桃等[11]研究优化长双歧杆菌DD98的冻干保护剂配方，在脱脂奶粉10%，海藻糖20%，Vc-Na 2%，纯化水68%的条件下冻干菌粉的存活率提高到90%。

目前，嗜酸乳杆菌等益生菌的冻干存活率普遍不高，为了提高益生菌的冻干存活率，提高益生菌的保藏效果，本文以前期从传统腊肠中筛选的具有体外降胆固醇和降甘油三酯功能的益生菌植物乳杆菌G1-28为研究对象，对菌体离心条件、冻干保护剂的选择及其复配及其冻干菌剂的保藏条件进行了系统的研究，为益生菌植物乳杆菌G1-28高活性冻干发酵剂的制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌G1-28 从传统腊肠中筛选的具有体外降胆固醇和降甘油三酯功能的乳酸菌，巢湖学院食品工程实验室保藏[12]；脱脂乳蒙牛牌 市售；甘油、海藻糖、山梨醇 北京奥博星生物技术有限责任公司。

TG16Ws台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；SHP-160智能生化培养箱 上海三发科学仪器有限公司；SW-CJ-2F洁净工作台 苏州市智拓净化设备科技有限公司；LGJ-30F真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌菌种扩大培养 将-20 ℃保藏的植物乳杆菌G1-28的甘油管融化，取1 mL接种到装有50 mL MRS液体培养基中，30 ℃静置培养14～16 h，无菌生理盐水离心洗涤3次，用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用[13]。

1.2.2 植物乳杆菌菌悬液离心条件的选择 将植物乳杆菌G1-28菌体100 mL培养液移入无菌离心管中，分别在3000、4000、5000、6000 r/min下离心10和20 min；弃去上清液，收获菌体，生理盐水洗涤后用于活细胞计数[14]。

1.2.3 植物乳杆菌冻干保护剂的确定 将经过培养和离心收集制备的植物乳杆菌G1-28的菌泥，测定细胞的活菌数N0，按照保护剂:菌泥为（w/v）2:1进行配比，利用涡旋混合器充分混匀后分装，在-40 ℃下预冻6 h，在真空度0.09 MPa，冷阱温度-51 ℃的条件下进行真空冷冻干燥22～24 h[11]。冻干后将冻干瓶-20 ℃存放48 h，30 ℃水浴中解冻。

1.2.3.1 脱脂乳对植物乳杆菌冻干菌剂细胞存活率的影响 将脱脂乳配成2%、4%、6%、8%、10%和12%的浓度作为保护剂，以不加脱脂乳的蒸馏水为空白对照，冻干后保藏解冻，测定植物乳杆菌G1-28活菌数N1，计算存活率。

1.2.3.2 海藻糖对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响 将海藻糖配成1%、2%、3%、4%和5%的浓度作为保护剂，以不加海藻糖的蒸馏水为空白对照，冻干后保藏解冻，测定植物乳杆菌G1-28活菌数N1，计算存活率。

1.2.3.3 山梨醇对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响 将山梨醇配成1%、2%、3%、4%和5%的浓度，以不加山梨醇的蒸馏水为空白对照，冻干后保藏解冻，测定植物乳杆菌G1-28活菌数N1，计算存活率。

1.2.3.4 甘油对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响

将甘油配成1%、2%、3%、4%和5%的浓度，以不加甘油的蒸馏水为空白对照，冻干后保藏解冻，测定活菌数N1，计算存活率。

1.2.4 冻干保护剂的正交试验 根据单因素实验结果，以细胞存活率为指标设计四因素三水平的正交实验，正交实验的因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Level of orthogonal experimental factors

1.2.5 植物乳杆菌冻干发酵剂保存性测定 将真空冷冻干燥后的植物乳杆菌G1-28发酵剂装入经灭菌处理的铝箔聚酯复合袋内，分别采用真空和常压包装，在-20、-4 ℃和室温下分别保藏2个月和4个月，进行平板菌落计数[14]。

1.3 数据处理

所有实验重复三次，每次两个平行样。采用SAS8.1软件进行实验分析。

2 结果与分析

2.1 离心条件的确定

离心是发酵剂制备的关键工艺环节，因此实验研究了离心转数及时间对收获的活细胞浓度的影响见表2。

表2 离心条件对活细胞浓度的影响Table 2 Effects of centrifugal conditions on the concentration of living cells

由表2可以看出，当离心转速为3000和4000 r/min时，由于离心转速较低，有些小细胞不易被收集，但当离心转速达到6000 r/min时，过高的离心转速容易导致细胞的死亡，使平板计数法测定的活细胞数较低，因此，较适宜的离心收集条件为5000 r/min，20 min，此时，收获的活细胞数是离心前的96.26%。

2.2 植物乳杆菌冻干保护剂的确定

2.2.1 植物乳杆菌冻干保护剂的单因素实验 微生物细胞在冷冻的过程中，细胞内大量水分结冰后会形成较大的冰晶，从而对微生物的细胞膜造成较大的损伤，导致冷冻后菌体细胞的死亡率很高。采用海藻糖、脱脂乳、山梨醇以及甘油等作为单一冷冻保护剂可降低细胞的死亡率[15]，因此实验研究了脱脂乳、海藻糖、山梨醇及甘油单独使用对冻干后乳酸菌存活率的影响。

2.2.1.1 脱脂乳对植物乳杆菌冻干菌剂细胞存活率的影响 脱脂乳的成分主要是蛋白质和乳糖，将其溶解在水中是一种胶体溶液，脱脂乳中的蛋白质颗粒的直径较小，在1～2 nm之间，将乳酸菌添加到脱脂乳溶液中，乳酸菌菌体细胞处于蛋白质分子的包围之中，在冷冻过程中可阻止细胞内形成大得冰晶，能对乳酸菌菌体细胞起到很好的保护作用，有助于保持乳酸菌菌体的活性[16]。Khem等[17]的研究也表明脱脂乳也能在干燥过程中降低升温的速度，减少细胞的压力，从而起到对细胞的保护作用。由图1可以看出，当脱脂乳浓度小于6%时，随着脱脂乳浓度的增加，细胞存活率明显增大，当脱脂乳浓度大于6%时，随着脱脂乳浓度的增加，细胞存活率略有下降但基本平稳。脱脂乳浓度过高，容易使细胞脱水，影响了细胞的形态，从而影响了菌体的存活率，因此通过单因素确定的脱脂乳适宜浓度为6%。

图1 脱脂乳浓度对细胞存活率的影响Fig.1 Effect of skim milk concentration on cell survival ratio

2.2.1.2 海藻糖对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响 在植物乳杆菌细胞冷冻的过程中，细胞中的蛋白质会发生脱水变性，海藻糖作为一种双糖，在蛋白质冷冻的过程中能填充到因蛋白质失水而形成的空缺中，从而有效的抑制微生物中的蛋白质在冷冻过程中发生的变性[18]。由图2可以看出，海藻糖添加量在0～2%范围内，随着海藻糖浓度的增加，植物乳杆菌细胞存活率逐渐提高；但当海藻糖浓度大于2%时，随着海藻糖浓度的增加，植物乳杆菌细胞存活率的呈现平稳趋势。Ambros等[19]研究也表明了在真空干燥状态下，海藻糖具有保护益生菌稳定性的作用。通过单因素实验确定海藻糖适宜浓度为2%。

图2 海藻糖浓度对细胞存活率的影响Fig.2 Effect of trehalose concentration on cell survival ratio

2.2.1.3 山梨醇对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响 由图3可以看出，山梨醇浓度在0～2%的范围内，随着山梨醇浓度的增加，植物乳杆菌细胞存活率逐渐提高，当山梨醇浓度为2%时，植物乳杆菌冻干后的存活率最高为60.50%。实验表明2%的山梨醇对植物乳杆菌起到了较好的保护作用。山梨醇具有良好的保湿性能，在溶液中会与水分子发生结合，容易渗透到微生物细胞内，在冷冻条件下可增加溶液的粘性，从而抑制水的结晶，能保护细胞的活性，和甘油一起使用具有增效作用[18]。因此，通过单因素实验确定山梨醇适宜浓度为2%。

2.2.1.4 甘油对植物乳杆菌冻干菌剂活菌数的影响

由图4可以看出，甘油浓度为0～3%时，随着甘油浓度的增加，植物乳杆菌细胞存活率逐渐提高，但当甘油浓度为3%时，植物乳杆菌细胞存活率最高，达到65.20%。甘油作为一种小分子物质，能以自由扩散的方式透过微生物的细胞膜。甘油易溶于水，并易与水分子发生结合作用。在添加了甘油的菌悬液中，微生物在冻干的过程中能通过水合作用增加溶液的粘性，减弱水的结晶过程，对活细胞有保护作用[20]。因此，通过单因素实验确定甘油适宜浓度为3%。

图3 山梨醇浓度对细胞存活率的影响Fig.3 Effect of sorbitol concentration on cell survival ratio

图4 甘油浓度对细胞存活率的影响Fig.4 Effect of glycerol concentration on cell survival ratio

2.2.2 冻干保护剂的正交试验

2.2.2.1 正交试验设计及结果 由单因素实验可以看出，脱脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油作为冻干保护剂能明显提高植物乳杆菌冻干菌种细胞的的存活率，但保护剂单独使用时，植物乳杆菌冻干后细胞最大的存活率只能达到65.20%，为了进一步提高植物乳杆菌冻干菌种的存活率，实验以单因素实验确定的脱脂乳6%，海藻糖2%，山梨醇2%，甘油3%为中心点，采用四因素三水平的正交实验，研究脱脂乳、海藻糖、山梨醇和甘油四种保护剂联合使用时，保护剂的最佳配比，正交实验结果见表3。

由表3可以看出，各因素对植物乳杆菌G1-28冻干菌体存活率影响的主次顺序依次是甘油＞海藻糖＞山梨醇＞脱脂乳。最佳培养基配方为A3B2C3D3，此配方不在正交试验的9组配方中，因此需要进行验证实验。

2.2.2.2 验证实验 根据正交试验所获得的最优冻干保护剂配方进行植物乳杆菌的冻干实验，即以脱脂乳7%，海藻糖2%，山梨醇3%，甘油4%为保护剂的条件下进行菌悬液的冻干实验，平均细胞存活率为93.20%±0.4%。正交试验结果证明了保护剂联合使用可提高菌体的存活率，这主要是由于不同的保护剂能通过不同的机理和方式对菌体起到保护作用。与本文研究结果相似，文献[16,21,22-23]也证明了复合保护剂的保护效果显著高于单一保护剂。Chen等[24]采用响应面优化方法优化了Bifidobacterium bifidumBB01冻干过程中的保护剂配方，在甘氨酸为5.5%，碳酸氢钠为0.8%，低聚木糖为7%，精氨酸为4.5%，脱脂牛奶为25%的复合保护剂中，细胞可存活率可提高至90.37%。Lee等[25]研究表明Lactobacillus plantarumJH287在真空冷冻过程中的最佳最佳保护介质为10%山梨醇和10%脱脂牛奶，在此条件下存活率可达86.37%。Chen等[24]和Lee等[25]确定的复合保护剂获得的细胞存活率略低于本实验的结果，与本文结果相同的是复合保护剂配方中脱脂牛乳都是主要的组分。这些研究结果表明乳酸菌冻干过程中复合保护剂可达到理想的保护效果，冻干后细胞的存活率可提高到85%以上。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experimental

2.2.3 冻干发酵剂保存性能测定 将真空冷冻干燥后的植物乳杆菌G1-28发酵剂，装入经灭菌处理的铝箔聚酯复合袋内，分别采用真空和常压包装，在-20、-4 ℃和室温下分别保藏2个月和4个月，进行平板菌落计数，测定植物乳杆菌细胞存活率，实验结果见表4。

由表4可以看出，在相同的保藏温度下，在真空保藏后，发酵剂中的植物乳杆菌细胞的存活率高于常压保藏，在真空保藏条件下，-20 ℃的低温保藏后发酵剂中植物乳杆菌细胞的存活率高于室温和-4 ℃条件下保藏。因此确定制备的冻干发酵剂在的适宜保藏条件为真空条件下-20 ℃保藏。王桃等[11]的研究也表明了较低的保藏温度更有力于冻干菌体活力的保持。

3 结论

论文以具有体外降胆固醇降甘油三酯功能植物乳杆菌G1-28为菌种，对其冻干发酵剂的制备过程中的离心、保护剂配方及保藏效果进行了系统的研究。实验结果表明植物乳杆菌G1-28菌悬液的离心收集条件为5000 r/min，20 min，在此条件下活细胞收集率为96.26%。植物乳杆菌G1-28最佳冻干保护剂为脱脂乳7%，海藻糖2%，山梨醇3%，甘油4%，在此条件下细胞存活率最大为93.20%。冻干菌粉保藏条件为在抽真空条件下-20 ℃保藏，保藏4个月，细胞存活率为97.1%。研究结果表明，复合保护剂可以通过多种保护机制来减少冷冻干燥对菌体细胞的损伤，其冷冻干燥后细胞的存活率明显高于单一保护剂。制备的植物乳杆菌G1-28菌粉可作为泡菜、苹果发酵饮料等的发酵剂，也可以作为益生菌菌粉直接食用，产品具有使用、运输、贮藏方便，不易污染杂菌等优点。下一步将进行扩大规模实验，为菌剂的生产及应用提供更直接的基础数据。

表4 发酵剂保存性测定Table 4 Determination of retention of starter