小球藻紫果西番莲多糖复合饮料研制及其对小鼠运动耐力的影响

2021-06-18李奕

食品工业科技 2021年10期

李奕

（中国戏曲学院体育部，北京 100073）

小球藻属于绿藻门小球藻科的单细胞绿藻，含有多糖、蛋白质、维生素、食用纤维及多种矿物元素。有研究显示[1-2]，其主要成分多糖的体外抗氧化作用较好，可增强机体免疫力，Okada等[3]指出该多糖缓解机体疲劳的活性较乳糖有显著性差异，因此被大量用于保健食品的研究开发。由于藻类食品通常存在特殊腥味，受欢迎程度较低，庞庭才等将其制备成相关发酵乳及复合饮料，以改善口感[4-5]；而史瑞琴等[6]则利用小球藻多糖制备相应口服液，使得口感提升。紫果西番莲是西番莲科多年木质藤本植物的果实，气味芬香浓郁，被赞誉为“果汁之王”，富含多糖、有机酸、维生素、氨基酸等营养物质[7-8]，贺银菊等[9]通过超声辅助提取其果肉多糖，发现其对活性氧自由基的清除作用较好。

由于运动性疲劳通常源于机体运动产生的大量活性氧自由基，促使体内氧化应激反应发生，造成组织损伤和肌肉收缩能力下降、出现“身心俱疲”现象[10-11]。而一般天然化合物的体内外活性高度相关[12]，且目前尚未有文献公开探讨小球藻与紫果西番莲相关食品的体内抗疲劳活性，因此本研究以上述两种物质的多糖为原料，利用紫果西番莲抑制小球藻异味，研制小球藻紫果西番莲多糖复合饮料，通过相关动物实验，观察其对机体运动耐力的影响，从而为相关运动食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

健康雄性小鼠 150只，体质量19～25 g，由北京实验动物中心提供（SYXK（京） 2015-0046），生长环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%；小球藻粉

西安瑞尔丽生物工程有限公司；紫果西番莲、蔗糖

北京明光寺水果批发市场；西洋参口服液山东鹤王生物工程有限公司；葡萄糖标准品中国食品药品检定研究院；苯酚、硫酸均为分析纯国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸济南鑫越化工有限公司；羧甲基纤维素钠河北百优生物科技有限公司；试验用水为蒸馏水。

YP-1000型电子天平上海越平仪器有限公司；TL-150Y型超声波细胞粉碎机江苏天翎仪器有限公司；PHS-3C型雷磁pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；X5型紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司；FB-110Q型高压均质机上海励途超高压设备有限公司；BKQ-B75II型立式压力蒸汽灭菌器爱来宝（济南）医疗科技有限公司；ZX-2200DE型超声波器上海知信实验仪器技术有限公司；FD-1A-80型真空冷冻干燥机上海兰仪实业有限公司；H1850R型台式离心机湖南湘仪检测设备有限公司；动物恒温游泳池上海艾研生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 小球藻多糖提取以蒸馏水为提取溶剂，小球藻粉以1:20质量体积比，于100 W超声破碎，97 ℃热水浸提3 h后，在8000 r/min下离心10 min，取上清液，加入4%三氯乙酸，4 ℃静置过夜离心（8000 r/min、10 min），取上清液加入95%乙醇，4 ℃静置过夜离心（8000 r/min、10 min）取沉淀，冷冻干燥即得小球藻粗多糖[6]。

1.2.2.2 紫果西番莲多糖提取以蒸馏水作提取溶剂，紫果西番莲果肉以1:5质量体积比，于330 W超声破碎，70 ℃热水浸提30 min后离心（5000 r/min、10 min），滤液冷冻干燥即得紫果西番莲粗多糖[8]。

1.2.2.3 调配 50%小球藻多糖水溶液和50%紫果西番莲多糖水溶液以固定比例混合后，加入一定剂量食品添加剂（相对多糖混合液的百分比）调配。

1.2.2.4 均质、灌装与灭菌调配后的料液均质搅拌2次后灌装（温度：60～70 ℃，压力：20～25 MPa），于121 ℃灭菌10 min，冷却，即得小球藻紫果西番莲多糖复合饮料[13]。

1.2.3 复合饮料配方优化

1.2.3.1 单因素实验设计根据预实验结果，分别考察小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比、蔗糖用量、柠檬酸用量及羧甲基纤维素钠用量对小球藻紫果西番莲多糖复合饮料的感官评分和离心沉降率的影响，具体如下：（1）固定蔗糖用量3%、柠檬酸用量0.2%、羧甲基纤维素钠用量0.3%，考察小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比（3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）的影响；（2）固定小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1:2、柠檬酸用量0.2%、羧甲基纤维素钠用量0.3%，考察蔗糖用量（1%、3%、5%、7%、9%）影响；（3）固定小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1:2、蔗糖用量3%、羧甲基纤维素钠用量0.3%，考察柠檬酸用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）的影响；（4）固定小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1:2、蔗糖用量3%、柠檬酸用量0.2%，考察羧甲基纤维素钠（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）用量的影响。

1.2.3.2 响应面试验设计在单因素实验基础上，以两种物质多糖溶液体积比（A）、蔗糖（B）、柠檬酸（C）和羧甲基纤维素钠（D）的用量为响应因素，感官得分为响应值（Y），设计四因素三水平响应面试验，利用Design-Expert软件的Box-Behnken试验设计原理，优化各组分配比，试验因素水平见表1所示。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.4 饮料感官品质评价

1.2.4.1 感官评价标准参考相关饮料评价标准[14-15]，并结合小球藻紫果西番莲多糖复合饮料特性，制定该复合饮料的感官评价标准，具体见表2所示，同时邀请10位食品专业人员，分别按照该标准，对不同组分配比制得的饮料进行感官评价，最终评分取结果的平均值。

表2 饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of the beverage

1.2.4.2 离心沉淀率称取复合饮料m0，置于离心管中，以3000 r/min，离心10 min后，对管内上清液称重记为m，照公式W（%）=（m0- m）/m0计算饮料的离心沉淀率W（%），平行测定六次[16]。

1.2.5 理化指标检测

1.2.5.1 pH值测定利用pH计检测复合饮料的pH值。

1.2.5.2 多糖含量测定葡萄糖对照品经120 ℃干燥恒重后，按照文献操作步骤[17]，分别加入苯酚与浓硫酸预处理样品后，于490 nm波长测定吸光度值，另作空白对照，随后以对照品溶液的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=1.026x+0.052 （r=0.9989），另于相同波长下测定该复合饮料的吸光度值，根据标准曲线回归方程，计算其多糖含量。

1.2.6 微生物指标检测按照国家标准操作步骤[18]，分别检测小球藻紫果西番莲多糖复合饮料的微生物菌落总数、大肠杆菌和致病菌。

1.2.7 动物实验

1.2.7.1 分组与给药设计 150只健康雄性小鼠适应性喂养7 d后，按体质量随机分为五组，即空白对照组，阳性对照组，复合饮料低、中、高剂量组，每组各30只，阳性对照组给予西洋参口服液灌胃0.20 mL/（g·d），低、中、高剂量组则分别灌胃复合饮料0.10、0.20、0.30 mL/（g·d），而空白对照组则以0.85%生理盐水替代饮料灌胃，全部动物每天灌胃1次，连续灌胃30 d，灌胃期间可自由喂食与饮水[19]。

1.2.7.2 负重游泳试验末次灌胃后，各组动物于鼠尾负重5%体重重物，置于25 ℃游泳池内开展负重游泳试验，记录小鼠自入水开始游泳至沉没超过10 s的时间，即为动物力竭游泳时间[20]。

1.2.7.3 体内生化指标检测负重游泳试验结束后，快速切除动物肝脏，制成10%肝脏匀浆，按照相关试剂盒说明书要求，检测各组小鼠体内的丙二醛（MDA）浓度及总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物歧化酶（GSH-Px）活力[21]。

1.3 数据处理

相关评价指标均采用均数、标准差描述，利用SPSS 19.0进行方差分析，检验水准α=0.05，当P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比对饮料品质影响不同小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比对饮料的品质影响，结果见图1。当小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比为1:2时，复合饮料的感官得分最高，此时溶液为浅黄绿色、透亮，且酸甜适中。若紫果西番莲多糖用量过多，溶液澄清度下降，离心沉淀率超过1%，而小球藻多糖用量过多，则饮料又异味明显，为便于响应面试验条件考察，因此确定小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1.5:1、1:1、1:2作为响应面因素考察水平。

图1 溶液体积比对饮料感官评价的影响Fig.1 Effect of volume ratios on the sensory evaluation of beverage

2.1.2 蔗糖用量对饮料品质的影响不同蔗糖用量对饮料的品质影响，结果见图2。从图2可见，随着蔗糖用量增多，饮料的感官评分先增大后减小，离心沉淀率基本不变，这可能归因于蔗糖用量较少，溶液涩味较重，但过多又甜味突出，因此选择蔗糖用量1%、3%、5%作为响应面因素考察水平。

图2 蔗糖用量对饮料感官评价的影响Fig.2 Effect of sucrose amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.3 柠檬酸用量对饮料品质的影响柠檬酸的添加不仅丰富饮料的口感，同时可调节溶液的酸碱性质，使得饮料品质长期稳定，因此考察不同柠檬酸用量对饮料的品质影响，结果见图3。从图3可知，当柠檬酸用量达到0.2%再增加时，饮料的感官评分开始下降，且离心沉淀率不断升高，这可能源于柠檬酸用量过多，会导致饮料的酸味明显，口感变差，而两种多糖在弱酸性条件溶解性较好，因此选择柠檬酸的用量0.1%、0.2%、0.3%作为响应面因素考察水平。

图3 柠檬酸用量对饮料感官评价的影响Fig.3 Effect of citric acid amount on the sensory evaluation of beverage

2.1.4 羧甲基纤维素钠对饮料品质的影响由于小球藻和紫果西番莲的多糖提取物中仍含有蛋白质、氨基酸等高分子杂质，致使饮料长期存放时，容易出现分层，因此采用羧甲基纤维素钠改善饮料的长期稳定性，考察不同羧甲基纤维素钠用量对饮料的品质影响，结果见图4。从图4可知，随着羧甲基纤维素钠用量递增，感官评分逐渐升高，至0.3%后才下降。这归因于羧甲基纤维素钠的添加，有助于溶液的离心沉淀率下降，但用量过多会造成溶液黏稠，进而影响口感，因此选择羧甲基纤维素钠用量0.2%、0.3%、0.4%作为响应面因素考察水平。

2.2 响应面优化试验

图4 羧甲基纤维素钠用量对饮料感官品质的影响Fig.4 Effect of sodium carboxymethylcellulose amount on the sensory evaluation of beverage

2.2.1 试验结果按照Box-Behnken设计原理，分别以小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比（A）、蔗糖（B）、柠檬酸（C）及羧甲基纤维素钠（D）用量为响应面考察因素，感官评分为（Y）为响应值，进行四因素三水平响应面分析，结果见表3所示。

表3 响应面试验结果Table 3 Results of the response surface experiment

上述试验结果进行多元回归拟合，得到以感官得分为目标函数，各参数编码值的二次多项回归模型：Y=84.97+2.64A+0.78B+1.20C+0.23D+0.14AB-0.56AC+0.45AD-0.082BC-0.22BD-0.22CD-0.40A2-0.73B2-0.79C2-0.16D2，对该模型进行显著检验与方差分析，结果见表4所示。

表4 响应面方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

从表4可知，该回归模型P＜0.01，表明该模型回归效果显著，较好反映实际结果，R2=0.9222显示模型拟合值与实际结果高度相关，而失拟项P=0.7752表明该模型方程不显著（P＞0.05）可准确反映各因素与响应值关系，一次项A、B、C对饮料的感官得分影响均极显著（P＜0.01），二次项B2、C2对感官得分影响也均显著（P＜0.05），但交互项AB、AC、BC、CD、AD、BD的影响均不显著（P＞0.05），另从表中F值得到，各因素对饮料的感官得分影响顺序为：小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比（A）＞柠檬酸用量（C）＞蔗糖用量（B）＞羧甲基纤维素钠用量（D）。

2.2.2 响应曲面分析与验证实验图5为不同考察因素的交互作用对饮料的感官得分影响，响应曲面越陡峭，感官得分(Y)受不同因素的交互作用影响越大[22-23]，从图5可知，两两因素交互响应面坡面陡峭顺序为：AC＞AD＞CD＞BD＞AB＞BC，即两种物质多糖溶液体积比和柠檬酸用量的交互作用响应面最陡峭，表明二者交互作用对饮料的感官品质影响最大，另对二次多项回归拟合方程进行极值分析，确定小球藻紫果西番莲多糖复合饮料的最佳配方为：小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1:2、蔗糖2.35%、柠檬酸0.14%、羧甲基纤维素钠0.4%，最高预测值为87.94分，按照1.2.4.1步骤评价，实际得分为（88.71±0.87）分，表明该回归模型可较好预测复合饮料的最佳配方。

2.3 复合饮料的质量指标结果

采用上述最佳配方制得的复合饮料呈浅黄绿色、色泽均一，紫果西番莲香味浓郁，酸甜适中，室温静置6个月未有明显沉淀与分层。该复合饮料的pH值为5.7；离心沉淀率为0.59%；多糖含量为5.62%；微生物菌落总数≤100 CFU/100 mL，未有大肠杆菌和其它致病菌检出。

2.4 复合饮料对小鼠力竭游泳时间的影响

负重游泳试验常被用于考察动物力竭游泳时间，以客观反映动物的运动耐力，利用该试验分别考察各组小鼠的运动耐力，结果见表5所示。从表5可见，与空白对照组相较，中剂量组小鼠的力竭游泳时间显著延长（P＜0.05），高剂量组小鼠的力竭游泳时间极显著延长（P＜0.01），而低剂量组力竭游泳时间虽有一定延长，但无显著性差异（P＞0.05），另外高剂量组与阳性对照组的力竭游泳时间差异，具有统计学意义（P＜0.05），表明一定剂量的复合饮料有助于提高动物的运动耐力，但相同剂量的作用效果弱于西洋参。

2.5 复合饮料对小鼠生化指标的影响

剧烈运动导致机体耗氧量增加，出现大量活性氧与自由基，进而发生氧化应激反应，生成丙二醛（MDA），损伤细胞膜、蛋白质和DNA[24]。总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物歧化酶（GSH-Px）是体内重要的抗氧化酶，其中T-SOD可有效清除超氧阴离子自由基，使其转化为过氧化氢，随后被GSH-Px还原成H2O和醇代谢[25]，使得体内过氧化作用被减轻，不同组别小鼠运动后的体内MDA含量和T-SOD、GSH-Px活力，见表6所示。

从表6可知，与空白对照组相较，中、高剂量复合饮料有助于明显增强动物体内T-SOD、和GSHPx活力(P＜0.01)，其中T-SOD活力增强率为9.33%、13.95%，GSH-Px活力增强率为10.07%、16.69%，并极显著降低体内生成的MDA含量（P＜0.01），下降率分别为18.18%、41.18%，而低剂量组的T-SOD、GSH-Px活力虽有一定增加，且MDA含量轻微下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），另外高剂量组的T-SOD、GSH-Px与MDA含量与阳性对照组相较，具有显著性差异（P＜0.05）。上述试验结果表明，小球藻紫果西番莲多糖复合饮料既能减少自由基引起的脂质过氧化反应，又可提高体内抗氧化酶活性，从而增强机体运动耐力。

3 结论

本研究以小球藻和紫果西番莲多糖为原料，辅以蔗糖、羧甲基纤维素钠研制小球藻紫果西番莲多糖复合饮料。通过单因素与响应面试验优化得到饮料的最佳配方为：小球藻与紫果西番莲的多糖溶液体积比1:2、蔗糖2.35%、柠檬酸0.14%、羧甲基纤维素钠0.4%，感官评分为（88.71±0.87）分，制得饮料呈浅黄绿色、色泽均一，紫果西番莲香味浓郁，酸甜适中，静置后未有明显沉淀与分层。中、高剂量的小球藻紫果西番莲多糖复合饮料可显著提高动物的运动时间，既能减少自由基引起的脂质过氧化反应，又可增强体内抗氧化酶活性，因而具有一定体内抗疲劳活性，从而在体育运动食品领域具有较好推广前景，但对该饮料在体内抗疲劳活性的具体机制，尚需进一步研究。