石菖蒲核心代谢效应物α-细辛醇对癫痫幼鼠海马区神经元形态及星形胶质细胞活化的影响

赵明明，许文青，陶凯歌，刘宇杰，刘美英，姚瑞芹

徐州医科大学，江苏徐州 221004

癫痫是以反复痫性发作为特征的慢性神经系统疾病，全球癫痫患者年增长240万左右，其中儿童期患者最多，患病率为0.4%～0.9%［1-2］。近年来，中药在治疗癫痫方面由于其低不良反应和显著疗效，引起医药界重视［3］。石菖蒲是临床上广泛用于治疗癫痫的一种中药材，本课题组前期研究发现α-细辛醇是石菖蒲的核心代谢效应物，并设计合成了α-细辛醇及其衍生物，已获得国家专利。司替戊醇是一种临床上用于难治性儿童癫痫Dravet综合征治疗的“孤儿药”，其可通过抑制神经细胞内乳酸脱氢酶（LDH）的活性来控制癫痫发作［4］。课题组前期研究发现，α-细辛醇可显著抑制LDH活性，且同摩尔剂量下优于阳性药司替戊醇［5-6］。2019年7月—2020年7月，我们观察了α-细辛醇对癫痫幼鼠海马区神经元形态及星形胶质细胞活化标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 健康清洁级新生11 d的SD大鼠30只，体质量21～29 g，由徐州医科大学动物实验研究中心提供，生产许可证号SCXK（鲁）2014007。主要试剂：α-细辛醇（西北大学），氯化锂、匹鲁卡品（美国Sigma公司），阿托品（上海陶素生化科技有限公司），兔抗GFAP一抗（Protenintech公司），山羊抗兔荧光二抗（美国Abcam公司）。主要仪器：正置荧光显微镜（日本Olympus公司），Odyssey激光成像系统（美国LI-COR公司）。

1.2 动物分组与模型建立 将30只大鼠随机分为正常组、模型组、溶剂对照组、阳性对照组和α-细辛醇组，每组6只，雌雄不拘。正常组不处理，其余各组制备癫痫模型。造模方法：腹腔注射氯化锂（125 mg/kg），18～20 h后 腹 腔注 射 匹 鲁卡 品（30 mg/kg）诱导癫痫发作。根据Racine相关标准对造模进行分级［7］，将Ⅳ级及以上癫痫发作定义为造模成功。如未达到造模成功标准，则每30 min重复腹腔注射匹鲁卡品10 mg/kg，重复3次及以上者剔除，本研究均注射一次造模成功。造模成功后持续观察幼鼠40 min，注射阿托品1 mg/kg，10 min后按体质量200 mg/kg注射水合氯醛终止癫痫发作。

1.3 药物干预 溶剂对照组、阳性对照组和α-细辛醇组分别在给予匹鲁卡品前15 min腹腔注射50 mg/kg Tween80、司替戊醇和α-细辛醇，正常组、模型组腹腔注射等体积生理盐水。每日给药3次，连续7 d。

1.4 幼鼠海马组织标本获取 每组取3只幼鼠在给药7 d后全麻，仰卧位固定，剪开胸腔充分暴露心脏；将灌注针插入心尖部，剪破右心耳后灌注。快速灌注生理盐水溶液，直至肝脏逐渐变为白色、右心耳流出清亮液体；以4%多聚甲醛固定液灌注血管，待幼鼠抽动停止、全身组织和器官僵硬后停止灌注。断头取脑，放入4%多聚甲醛中固定12～24 h。固定后的脑组织先后经15%、30%蔗糖溶液脱水，待大脑完全沉入30%蔗糖后取出。在冰冻切片机内用OCT将脑组织进行包埋，并进行海马组织连续冠状切片，切片厚度约30μm，用于尼氏染色、免疫荧光染色。各组剩余幼鼠在全麻下冰上快速断头处死，取海马部位脑组织并称重，放入-80℃冰箱备用，用于Western blotting检测。

1.5 幼鼠海马组织神经元形态观察 采用尼氏染色法。各组取切片5张，经二甲苯及梯度乙醇处理，蒸馏水冲洗后置于1%甲苯胺蓝染液中浸染30 min。蒸馏水冲洗后于95%乙醇中分化2～3 min，使用无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察并摄片。

1.6 幼鼠海马组织GFAP蛋白检测 ①免疫荧光染色：各组取5张与尼氏染色相邻的切片，0.01 mol/L PBS冲洗、晾干后，加封闭液37℃封闭40 min；切片晾干，滴加一抗，室温放置30 min，4℃过夜。取出切片，复温、冲洗、晾干后，避光滴加荧光二抗，室温孵育2 h；冲洗后滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染剂室温放置5 min，用PBS冲洗、晾干。加甘油缓冲液封片，在显微镜下观察GFAP蛋白阳性颗粒（红色荧光）的表达情况并摄片。采用Image J软件分析图像积分光密度（IOD）值并计算平均光密度（MOD）。MOD=IOD/图片总面积（AREA）。MOD值越高，表示GFAP表达越高。②Western blotting：每50 mg脑组织加入200μL蛋白裂解液和2μL蛋白酶抑制剂，充分匀浆后4℃离心机离心，取上清层分装。按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度，并按最低浓度配平各组蛋白浓度。上清内加入相应量的蛋白上样缓冲液，沸水浴15 min后分装备用。配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样后经凝胶电泳分离，电转移至NC膜上。转移后用5%脱脂奶粉封闭，然后滴加GFAP一抗（稀释比例1∶5 000）孵育，4℃过夜。洗膜后，滴加荧光标记的山羊抗兔抗体（稀释比例1∶5 000），37℃反应2 h。洗膜3次后用Odyssey激光成像系统扫描图像，用Image J软件对结果进行分析。以β-actin为内参，计算GFAP蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以-x±s表示，组间比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组海马组织神经元形态比较 正常组海马CA1和CA3区可见大量致密的锥体细胞，神经元排列整齐，形态完整，染色质分布均匀；尼氏染色均匀、无凝集、无分散。造模7 d后的模型组与溶剂对照组海马CA1和CA3区尼氏染色减弱，部分神经元细胞形态不完整，细胞肿胀或皱缩，轮廓模糊，界限不清；细胞间距增加，排列疏松紊乱。与模型组相比，阳性对照组和α-细辛醇组海马CA1和CA3区多数锥体细胞边缘清晰，形态基本正常，神经元排列整齐呈条带状，尼氏染色较均匀。见OSID码图1。

2.2 各组海马组织GFAP蛋白表达比较

2.2.1 各组海马组织免疫荧光染色结果比较 海马CA1和CA3区GFAP蛋白阳性颗粒及MOD值模型组、溶剂对照组＞阳性对照组、α-细辛醇组＞正常组（P均＜0.05）；模型组与溶剂对照组、阳性对照组与α-细辛醇组GFAP MOD值差异无统计学意义。见表1、OSID码图2。

表1 各组幼鼠GFAP蛋白MOD值比较（-x±s）

2.2.2 各组海马组织Western blotting检测结果比较 正常组、模型组、溶剂对照组、阳性对照组、α-细辛醇组GFAP蛋白相对表达量分别为0.59±0.02、0.88±0.05、0.91±0.05、0.60±0.05、0.59±0.04；模型组、溶剂对照组＞阳性对照组、α-细辛醇组＞正常组（P均＜0.05），模型组与溶剂对照组、阳性对照组与α-细辛醇组GFAP蛋白相对表达量比较差异无统计学意义。见OSID码图3。

3 讨论

癫痫是儿童多发的脑神经失调性疾病，药物治疗仍为目前癫痫的主要治疗方法。临床上广泛运用的西医抗癫痫药（AEDs）有菲尔氨酯、拉莫三嗪、司替戊醇、普瑞巴林等，而这些药物仅能起到60%～80%的疗效，始终无法根治癫痫，依然有30%～40%的患者会恶化成难治性癫痫［8］。长期服用AEDs还可能出现诸多不良反应，如恶心、头痛、失调、神经性厌食、肝损伤、肠功能紊乱、困倦等。目前，药物的不良反应以及患者对药物产生的耐药性已成为现有AEDs治疗失败的主要原因［9］。Dravet综合征是一种比较复杂且难以根治的疾病，属于难治性儿童癲痫。因此，开发多（新）靶点、低毒性、低不良反应且适于儿童服用的药物兼具紧迫性与挑战性［10］。

中药治疗癲痫早在《黄帝内经》中就有记载，中医基础理论认为癫痫属于痫病范畴。随着研究的不断深入，中药在治疗癫痫方面由于其疗效显著、不良反应小，逐渐被临床广泛应用。迄今为止，2015版《中国药典》共收录14种抗癫痫中药复方及制剂。本课题组前期研究发现，α-细辛醇作为“远志－石菖蒲”药对及化学药“α-细辛脑胶囊”的核心代谢效应物，与现有AEDs的结构显著不同，是一种全新的抗癫痫活性分子骨架；其对多种类型的动物癫痫模型有较好抗癫痫活性、较低神经毒性，具有良好的开发优势，值得继续深入研究［11］。

神经元丢失和胶质细胞活化增殖是癫痫的特征性病理改变，而在各种胶质细胞中星形胶质细胞占50%～60%。星形胶质细胞不仅能回收和释放神经递质，缓冲细胞外钾离子，参与血脑屏障和突触的形成，还参与神经传递和代谢调节，为神经元提供稳定的微环境［12］。越来越多的研究表明，星形胶质细胞在癫痫发生与发展过程中扮演了重要角色，星形胶质细胞的激活或增殖会导致细胞内外神经递质、代谢酶、离子浓度等变化，进而参与癫痫的发病过程［13-16］。因此，通过干预功能失调的星形胶质细胞可能是治疗癫痫新的潜在治疗策略。

本研究以SD大鼠幼鼠为研究对象，利用氯化锂—匹鲁卡品制备幼鼠癫痫模型，用石菖蒲核心代谢物α-细辛醇连续给药7 d，观察海马区神经元形态及星形胶质细胞活化的变化。结果显示，α-细辛醇对癫痫幼鼠海马区神经元细胞的形态改变和星形胶质细胞活化有抑制作用。这提示α-细辛醇能够减缓氯化锂—匹鲁卡品诱导癫痫幼鼠海马区神经元损伤并抑制星形胶质细胞活化，从而抑制癫痫的发生发展。本实验为α-细辛醇作为一种新的抗难治性癫痫药物的开发提供了实验依据，但其具体抗癫痫作用的机制以及神经毒性还需要进一步研究。