蛹虫草N6-(2-羟乙基)腺苷与多糖组合给药对小鼠睡眠的影响

聂开美 杜思邈 陈 梅 李成溪 吴玉乾 陈玉皎,2* 曹 军*

蛹虫草N6-(2-羟乙基)腺苷与多糖组合给药对小鼠睡眠的影响

聂开美1杜思邈1陈 梅1李成溪1吴玉乾1陈玉皎1,2*曹 军1*

（1. 贵州贵安精准医学研究院股份有限公司，贵州 贵安 561113；2. 重庆大学生物工程学院，生物流变科学与技术教育部重点实验室，重庆 400044）

为开发出预防和治疗失眠的食用菌保健食品或药品，以蛹虫草为原料获得虫草多糖和N6-(2-羟乙基)腺苷，采用45%的虫草多糖配比55%的N6-(2-羟乙基)腺苷组合给药小白鼠，通过小鼠自发活动实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间实验等，观察组合给药对小鼠镇静催眠的的影响，并进一步开展小鼠急性毒性实验初步考察配比给药的安全剂量。结果：N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖在实验配比条件下给药，可改善小鼠睡眠质量，与单独N6-（2-羟乙基）腺苷给药相比，提高了小鼠入睡率。

蛹虫草；N6-(2-羟乙基)腺苷；虫草多糖；药理作用；睡眠

失眠是指机体内在气血、脏腑功能失调，导致经常性睡眠时间不足的一种病症[1]，会出现注意力不集中、理解能力下降等症状[2]。传统抗失眠药物副作用大，致依赖性较强，因此开发健康的预防和治疗失眠的食品或药品，成为科学研究的新方向。中医认为治疗失眠时应治未病[3]。非处方药圣约翰草提取物能改善失眠及焦虑，在欧洲、美国得到广泛应用[4]。文献报道许多天然药物如冬虫夏草、花生叶、半夏汤等的提取物也具有良好的镇静作用[5]，但这些天然药物都具有服药剂量大、服用时间长等缺点。

蛹虫草（），亦称北冬虫夏草，在分类学上与冬虫夏草同归于虫草属，是一种珍贵的药用真菌，具有较高的药用价值。有关研究表明，蛹虫草含有虫草酸、虫草素、虫草多糖和超氧化物歧化酶等生物活性物质，蛋白质、脂类、糖类、维生素及对人体有益的微量元素含量也十分丰富[6]。由于冬虫夏草对生长环境的要求苛刻，导致资源极为有限而不能满足日益增加的市场需求。目前，人工栽培蛹虫草已获成功，并实现了规模化生产，我们可在一定程度上用人工栽培蛹虫草代替冬虫夏草入药。

N6-(2-羟乙基)腺苷又名虫草菌素，是天然的腺苷类似物，而腺苷很早就被认为是内源性的睡眠调节剂，20世纪50年代起就有报道腺苷对猫的催眠效应[6]。WANG等通过实验证明N6-(2-羟乙基)腺苷（合成）在小鼠体内可引起移动性减少，具有显著的镇静催眠效果[6]。虫草多糖是蛹虫草中另一种重要的活性物质，在蛹虫草中多糖的含量为4%～10%[8]。其主要功能是增强免疫力，还具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等作用[9]，但其作用机理尚不明确。蛹虫草多糖提取一般先用乙醚脱脂，再经热水提取、乙醇沉淀得粗多糖。

我们选取蛹虫草（干蚕蛹和大米生产）为原料，通过溶剂提取、色谱分离获得虫草多糖与N6-(2-羟乙基)腺苷，开展二者组合给药对戊巴比妥钠阈上剂量和阈下剂量致小鼠睡眠的影响，并探讨组合用药是否具有药理毒性，以期开发一系列绿色、健康的具有预防和治疗失眠功效的药物，为因失眠而影响生活的大众解决睡眠健康问题。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

蛹虫草，购自正源堂（天津）生物科技有限公司，组合样品为[N6-(2-羟乙基)腺苷55%、虫草多糖45%，20140514]、枣仁安神胶囊（贵州同济堂制药有限公司，121104）、艾司唑仑片（天津太平洋制药有限公司，130503）、戊巴比妥钠（Sigma公司分装）、色谱甲醇（天津市康科德科技有限公司）、95%乙醇。

1.2 试验动物

KM小鼠18～25 g，雌雄各半，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001，合格证号：11400700020779。动物来源于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2012-0004，饲料来源于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，SCXK（军）2007-001。饲养环境：普通级，室温，常规饲喂。

1.3 仪器与设备

DAC150（150×250 mm，C18，10 µm）（江苏汉邦科技有限公司）、Xcharge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，100 Å）（华谱新创科技有限公司）、注射器（上海治宇医疗器械有限公司）、秒表、EL电子天平（常州天之平仪器设备有限公司）。

2 实验设计

2.1 虫草多糖的制备与总糖、蛋白质含量测定

2.1.1 虫草多糖的制备

称取蛹虫草子实体进行超低温粉碎得到超微粉，利用超纯水进行3次加热提取，每次3 h，合并提取液后浓缩得到水提取浓缩液。将上述水提取浓缩液用适量水分散，将其加入体积分数为95%的乙醇并迅速搅拌，充分混匀，将乙醇浓度调至80%，4 ℃冰箱中冷藏静置沉淀过夜，离心，获得上清液和沉淀，上清液备用，沉淀即为虫草多糖。

2.1.2 总糖含量的测定[10]

（1）葡萄糖标准曲线的测定。分别吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖标准溶液至10 mL具塞试管，用蒸馏水补至1.0 mL，向试液中加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL浓硫酸，添加时需与液面垂直，勿接触试管壁，以便于反应液充分混合，反应液静止放置10 min。使用涡旋振荡器使反应液混合，然后将试管放置于30 ℃水浴锅中反应20 min。取适量反应液在490 nm处测吸光度。

（2）测定多糖含量。将干燥至恒重的粗多糖50 mg，用减量法称取后放置在100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，获得试样测试液。准确吸取试样测试液0.2 mL于10 mL具塞试管中，用蒸馏水补至1.0 mL，按步骤2.1.2（1）操作，以空白溶液调零，测得虫草多糖吸光度，以标准曲线计算总糖含量。

2.1.3 蛋白含量的测定[11]

（1）牛血清白蛋白标准曲线制备。精确量取0.5 mg/mL牛血清白蛋白0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL分别置于试管中，补蒸馏水至0.5 mL，再依次加入0.1 mg/mL 的考马斯亮蓝染料3 mL，摇匀。室温下放置15 min，在595 nm波长处测定吸光度。

（2）样品蛋白含量测定。将干燥至恒重的粗多糖500 mg，用减量法称取后放置在50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，获得试样测试液。取样品溶液0.5 mL于试管中，按标准曲线方法操作，然后测定595 nm波长处的吸光度，并以标准曲线计算样品中蛋白质的量。

2.2 N6-(2-羟乙基)腺苷制备与纯化[12 ]

将步骤2.1.1中所述的上清液浓缩干燥获得粗N6-(2-羟乙基)腺苷。称取一定量粗N6-(2-羟乙基)腺苷，加入15%甲醇/水溶解至浓度为200 mg/mL，微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法进行分离纯化，色谱柱为DAC150（150 mm×250 mm，C18，10 µm），洗脱方式为15%甲醇/水等度洗脱70 min，检测波长为260 nm，收集52～67 min馏分。

取提纯后N6-(2-羟乙基)腺苷粉末用100%甲醇溶解至浓度为100 mg/mL，微孔滤膜滤过，用高效液相色谱纯度验证，色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），洗脱方式为25%甲醇/水等度洗脱30 min，流速0.3 mL/min，检测波长为260 nm。

2.3 N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药的小鼠睡眠表现

2.3.1 动物分组及给药方法

小鼠（雌雄各半）随机分为枣仁安神胶囊组、艾司唑仑片组、空白组和N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药低、中、高剂量组，共6个组，每组12只。枣仁安神胶囊组给予枣仁安神胶囊灌胃剂292.5 mg/kg∙d灌胃，艾司唑仑片组给予艾司唑仑片灌胃剂0.029 mg/kg∙d灌胃，空白组在相同给药时间及给药时长灌胃给予生理盐水，N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药低、中、高剂量组分别给予组合样品14.6 mg/kg∙d、29.1 mg∙/kg∙d、58.2 mg/kg∙d，连续灌胃15天。

2.3.2 实验方法及观察指标

（1）腺苷与虫草多糖组合用药对小鼠自发活动（旷野法）的效应。动物末次给药1 h后，采用旷野法将小鼠放入100 cm×100 cm×40 cm无盖箱，箱底画有10 cm×10 cm的格子，待小鼠适应5 min后，记数2 min内小鼠爬过的格子数，连续2次，取平均值进行结果统计分析。

（2）腺苷与虫草多糖组合用药对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间的影响。动物末次给予枣仁安神胶囊、艾司唑仑及不同剂量腺苷与虫草多糖组合用药1 h后，各组动物腹腔注射戊巴比妥钠阈上催眠剂量（使100%动物入睡，但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠腹腔注射剂量），以翻正反射消失为指标，观察腺苷与虫草多糖组合用药能否延长阈上剂量戊巴比妥钠使小白鼠翻正反射消失的时间。记录入睡潜伏期（腹腔注射至翻正反射消失的时间）和睡眠持续时间（翻正反射消失至恢复的时间）。

（3）腺苷与虫草多糖组合用药对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠发生率的影响。动物末次给药1 h后，每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠阈下催眠剂量（使90%～100%的动物翻正反射不消失的最大剂量），记录30 min内入睡动物数（翻正反射消失达1 min以上者），计算入睡动物发生率。

2.3.3 N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药急性毒性考察

小鼠（雌雄各半）空腹12 h后，随机分为腺苷与虫草多糖组合用药低、中、高剂量组和空白组，组合用药组分别一次灌胃给药1.25 g/kg、2.5 g/kg、5 g/kg。每日记录各组小鼠体重与饮食量变化、观察是否有死亡现象与中毒反应的发生。

3 实验结果

3.1 虫草多糖的含量

如图1，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线，制得回归方程：y=0.0097x + 0.0023，R2=0.9995。从表1可知，虫草多糖含量为25.67%。

图1 葡萄糖标准曲线

3.2 粗多糖中的蛋白含量

如图2，以A595nm值为横坐标，牛血清蛋白浓度（mg/mL）为纵坐标，做标准曲线，制得回归方程：y=4.4543x+0.8883，R2=0.9915。测得样品蛋白浓度为0.142 mg/mL，蛋白含量为1.42%。

表1 虫草多糖含量测定结果

图2 考马斯亮蓝标准曲线

3.3 N6-(2-羟乙基)腺苷HPLC

经过HPLC测样，得到其色谱图（图3）。通过计算，其N6-(2-羟乙基)腺苷纯度为98.878%。

图3 N6-(2-羟乙基)腺苷HPLC色谱图

3.4 N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药的小鼠睡眠表现

给予连续灌胃15天后，组合用药高剂量组（58.2 mg/kg）与空白组比较，小鼠在一定时间内爬过格子数有极显著差异（<0.01），与中药对照组（枣仁安神胶囊组）比较无显著差异，其余各组与空白组比较有显著差异（<0.05）（图4a）；在睡眠持续时间方面，组合用药给予剂量为58.2 mg/kg时，与空白组比较有极显著差异（<0.01），与中药对照组（枣仁安神胶囊组）比较无显著差异（图4b）；在阈下剂量入睡率方面，各组入睡率均高于空白组，且当剂量为58.2 mg/g时，其入睡率与中药对照组（枣仁安神胶囊组）相当，组合样品在给予剂量为14.6 g/kg时，其入睡率与西药对照组（艾司唑仑组）相当（图4c），且入睡率与给药剂量呈剂量依赖性；在入睡潜伏时间方面，各给药组与空白组比较均有极显著差异（<0.01），直观观测组合样品各组别药效略差于中药对照组（枣仁安神胶囊组）及西药对照组（艾司唑仑片组）（图4d）。

3.5 N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药的小鼠体重与急性毒性表现

一次给药15天后，组合样品在1.25～5.0 g/kg范围内，减缓了小鼠体重的增长（图5a），其影响程度与给药剂量呈正相关关系；组合样品也影响小鼠的每日摄食量（图5b），其与给药剂量也呈正相关关系，由此推测，组合样品可能通过减少小鼠的摄食量而影响其体重增长。在给药剂量1.25～5.0 g/kg范围内，小鼠未出现死亡现象，存活率均为100%；但有不同程度的中毒可逆反应，如竖毛、困倦，涉及到自主神经系统及睡眠中枢系统，且中毒反应随给药量的减少发生率降低或持续时间缩短。小鼠解剖后机体各主要脏器无肉眼可见异常。

4 讨 论

根据上述结果，我们认为N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药可减少机体的自主活动性，缩短入睡前时间。在给药剂量为58.2 mg/kg时，N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药对小鼠入睡率和睡眠时间的效应显著，可显著延长睡眠时间和提高小鼠入睡率，改善睡眠质量。说明组合用药催眠效果明显，催眠作用与中药对照组（枣仁安神胶囊组）相当，且入睡率与给药剂量呈正相关性，组合用药浓度越高，入睡率越高。急毒实验结果，小鼠存活率为100%，未出现死亡现象，初步证明N6-(2-羟乙基)腺苷与虫草多糖组合用药的安全性。这为虫草多糖进一步深入研究和推广应用于治疗失眠方面提供了科学依据。

a：每组小鼠的平均体重； b：每组小鼠的平均饮食量。

失眠是一种常见病、多发病。随着现代社会生活节奏的加快，工作、学习压力的增大，使失眠成为临床常见病症，不仅给患者的身心健康带来影响，还会导致严重的社会问题。根据中医理论，蛹虫草可能通过补肾益精使精血充足而致养心安神，从而达到镇静催眠[13]。以本实验室已有的实验数据为基础，通过阅读大量相关文献，建立了一种高效、简便易行、绿色、便于工业化的蛹虫草N6-(2-羟乙基)腺苷提取分离工艺。将虫草多糖与N6-(2-羟乙基)腺苷组合用作抗失眠药物，与单独N6-(2-羟乙基)腺苷给药相比[14]，提高了小鼠入睡率。研究表明，N6-(2-羟乙基)-腺苷抗失眠作用机制可能与作用于腺苷A 2受体有关[15]。腺苷可作为一种睡眠因子，在睡眠-觉醒调控中发挥重要作用[15]。

失眠作为中医治疗的优势病种之一，选择中医药治疗越来越受到人们的重视和青睐。本研究从中医组分中药治疗疾病思路出发，采用活性组分组合给药的方式，考察其对失眠的效应，这是本研究的创新点。实验结果为后期建立特定的失眠症状模型供进一步研究打下良好基础。

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Effects of N6-(2-hydroxyethyl) adenosine combined with polysaccharide fromon the sleep of mice

Nie Kaimei1Du Simiao1Chen Mei1Li Chengxi1Wu Yuqian1Chen Yujiao1,2Cao Jun1

（1. Guizhou Gui’an Academy of Precision Medicine Co. Ltd., Gui 'an,Guizhou, 561113, China; 2. Bioengineering Clllege of Chongqing University, Key Laboratory of Biorheological Science and Technology Ministry of Education, Chongqing, 400044, China）

To develop healthy foods or medicines for the prevention and treatment of insomnia,was used as raw material to obtain polysaccharide and N6-(2-hydroxyethyl) adenosine, and the combination of 45% polysaccharide and 55% N6-(2-hydroxyethyl) adenosine is administered by spontaneous mice activity experiments, and the effects of combined administration on sedation and hypnosis in mice were observed through spontaneous activity experiments in mice and pentobarbital sodium sleep time experiments, and further carry out the acute toxicity experiments to preliminarily investigate the drug safety dose. The results showed that the administration of N6-(2-hydroxyethyl) adenosine and polysaccharide under the experimental conditions can improve the sleep quality of mice, and can improve the sleep rate compared with N6-(2-hydroxyethyl) adenosine alone.

N6-(2-hydroxyethyl) adenosine; polysaccharide; pharmacological action; sleep

R965.1，S567.3

A

2095-0934（2021）03-216-06

贵州省科技支撑计划项目（No.黔科合支撑[2017]2960）

聂开美（1992—），女，硕士，主要从事生物制药研究。E-mail：nkm295827@126.com。

曹军，男，研究员，主要从事中医药、基因测序、生物制药等成果转化工作。E-mail：htjingong@sina.cn。

陈玉皎，女，博士，主要从事中医药成果转化、基因测序、生物制药等研究工作。E-mail：chenyujiao623198@126.com。