禽腺病毒(C种，4型)精制卵黄抗体研制及免疫效果评价

杜东颖，黄晓静，刘武杰，段佳蕾，盛东北，田 辉，王孟月，姚延丹，张盼涛*，田克恭*

(1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000;2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000)

鸡的禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)感染在世界上许多国家均有报道，其中尤以禽腺病毒(C种，4型)(FAdV-4)的危害最为严重，临床表现为“心包积液-肝炎综合征”。近几年来，该病在我国华中、华东等地区广泛流行，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。该病可通过水平和垂直两种途径传播，黄羽肉鸡、白羽肉鸡、蛋鸡、种鸡等均可感染发病[1-2]。

研究证实FAdV-4基因组含2个Fiber阅读框，分别编码Fiber-1和Fiber-2蛋白，其中Fiber-2蛋白在病毒的入侵、增殖、组装和释放过程中发挥重要作用[3]，同时该蛋白可刺激机体产生中和抗体，从而诱导机体产生较强的免疫反应[4]。Ⅰ群禽腺病毒根据血清学关系、体外培养特征和核酸特性分为A～E 5个种和12个血清型[5-6]，Ⅰ群禽腺病毒12个血清型之间交叉保护性较差，因此在防控上必须选用与流行株匹配的免疫原或抗体才能有效遏制疫情的蔓延[7-8]。目前国内市场上尚无商品化的免疫原或抗体，常见的抗病毒和抗菌药物防治Ⅰ群禽腺病毒感染的效果不佳，且耐过鸡发育受阻，严重影响经济效益[9]。

卵黄抗体接种是一种有效的防控手段，在动物疫病防控中发挥重要作用。但以鸡胚或细胞培养病毒的方式生产抗原，存在着生产成本高、病毒滴度低的问题，灭活免疫原免疫蛋鸡后血清抗体滴度较低，制备的卵黄抗体效价偏低，预防效果不佳。因此，急需开发出成本可控、预防效果良好的卵黄抗体来有效防控Ⅰ群禽腺病毒感染。本研究首次采用大肠杆菌表达系统制备的抗原蛋白Fiber-2免疫蛋鸡制备卵黄抗体，并对其防治效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 质粒、毒种C种4型禽腺病毒FAV-HN株均由本实验室分离、鉴定和保存。

1.2 主要试剂限制性内切酶NdeⅠ、HindⅢ酶、T4 DNA连接酶购自美国New England Biolabs公司；C种4型禽腺病毒AGP抗原和阳性血清(AGP效价为1∶16)均由本实验室制备并保存；禽腺病毒Ⅰ群(FADV-I)抗体ELISA试剂盒购自荷兰BioChek；层析介质Ni Sepharose 6 Fast Flow购自General Electric Company；白油购自北京华美润；吐温-80及司本-80均购自广东超能；甲醛等分析纯购自国药集团。

1.3 实验动物SPF鸡由购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司的种蛋自行孵化、饲养至所需日龄；140～160日龄海兰褐蛋鸡购自洛阳周边某鸡场，该鸡群无Ⅰ群禽腺病毒感染和相关免疫原免疫史，本次试验使用的蛋鸡经禽腺病毒Ⅰ群(FADV-I)抗体ELISA试剂盒检测为阴性。

1.4 Fiber-2蛋白表达与纯化参考GenBank上公布的Ⅰ群禽腺病毒(4型)Fiber-2蛋白基因序列(FR872912.1)，利用Primer 5.0软件，设计扩增Fiber-2基因的引物，上游引物Fiber-2 F：5′-GGGAATTCCATATGATGCTCCGAGCCCCTAAA-3′(下划线序列为NdeⅠ)；下游引物Fiber-2 R：5′-CCCAAGCTTTTACGGGACGGAGGCTGCTG-3′(下划线序列HindⅢ)。以提取的病毒液DNA为模板进行Fiber-2基因的扩增，pET-28a载体和Fiber-2基因经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切后，利用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组表达载体pET-28a-FAdV-Fiber-2。

将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落至LB液体培养基中(卡那霉素的质量浓度为50 mg/L)，37℃培养过夜；将菌液按照1∶100的体积比加至LB液体培养基中；37℃继续培养至菌液D600值达0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG进行诱导，28℃继续培养12 h；对诱导后的菌体进行超声裂解，离心取上清利用Ni SepharoseTM 6 Fast Flow镍柱层析纯化，收集洗脱蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，PBS透析后过滤除菌，并利用Ⅰ群4型禽腺病毒阳性血清进行琼脂扩散试验，测定Fiber-2蛋白液的AGP效价。

1.5 免疫原制备及检验取AGP效价不低于1∶32的Fiber-2蛋白液，按照水相与油相1∶2的比例制备C种4型禽腺病毒免疫原，按现行的《中国兽药典》附录对其进行性状检验、无菌检验及安全性检验。

1.6 免疫产蛋鸡将制备的免疫原通过肌肉注射140～160日龄商品蛋鸡，1.0 mL/只，首免后21 d以相同方法和剂量进行加强免疫；二免后14 d以相同方法和剂量进行第3次免疫；三免后，每隔10 d抽样检测鸡蛋蛋黄中C种4型禽腺病毒AGP抗体效价，效价不低于1∶64时收集高免蛋，置2～8℃贮存。

1.7 精制卵黄抗体的制备将高免蛋进行消毒和喷雾熏蒸，采取手工或机械打蛋，充分除去蛋清、胎盘和系带，收集蛋黄。充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积灭菌并冷却的蒸馏水62.5℃灭活30 min。向灭活后的蛋黄液中加入相当于原蛋黄7倍体积的灭菌蒸馏水(pH 4.2)中，并降温至2～8℃，边加边搅拌，2～8℃静置4 h；14 000 r/min离心取上清，并向上清中加入终浓度为0.2%的辛酸，搅拌均匀，室温放置2～4 h后进行粗滤，取上述滤液加入终浓度为0.1%的甲醛溶液37℃灭活12 h，制得精制卵黄抗体，测定精制卵黄抗体的AGP效价。

1.8 抗体防治效果评价

1.8.1感染前注射抗体的防治效果 50只SPF鸡随机分为5组，10只/组，其中4组分别于35,37,39和41日龄肌肉注射精制卵黄抗体，另1组于41日龄皮下注射精制卵黄抗体，注射剂量均为1 mL/只。上述5组注射抗体的SPF鸡于42日龄时腿部肌肉注射C种4型禽腺病毒FAV-HN株，0.5 mL/只(含106.0TCID50)。同时设置10只相同日龄的SPF鸡作为对照，仅感染病毒，不注射抗体。感染后连续观察14 d，记录各组SPF鸡的发病症状和死亡剖检变化，评价精制卵黄抗体的防治效果。

1.8.2感染后注射抗体的防治效果 42日龄SPF鸡40只随机分为4组，10只/组，腿部肌肉注射C种4型禽腺病毒FAV-HN株，0.5 mL/只(含106.0TCID50)。感染后24 h，其中2组分别通过皮下和肌肉途径注射精制卵黄抗体1 mL/只，另外2组分别通过皮下和肌肉途径注射精制卵黄抗体2 mL/只。同时设置1组(10只)同日龄SPF鸡为对照组，仅感染病毒，不注射抗体。感染后连续观察14 d，分别根据各组SPF鸡的临床发病症状和死亡剖检病变情况对精制卵黄抗体的紧急预防效果进行评价。

2 结果

2.1 Fiber-2蛋白表达与纯化利用Ni Sepharose 6 Fast Flow对大肠杆菌表达的Fiber-2蛋白进行亲和层析纯化，将纯化后的蛋白同时经SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析，在55～70 kDa可见到明显目的条带，蛋白纯度可达90%以上，结果如图1所示。经琼脂扩散试验测定纯化后蛋白的AGP效价为1∶64。

M.预染蛋白Marker;1.纯化后的Fiber-2蛋白

2.2 免疫原检验对制备的C种4型禽腺病毒亚单位免疫原进行性状检验、无菌检验及安全性检验。性状检验结果显示，免疫原为油包水型的乳白色均匀乳剂，取10 mL免疫原以3 000 r/min离心15 min，无水相析出，稳定性良好。无菌检验结果表明免疫原无细菌、霉菌等污染。用14日龄SPF鸡10只，颈部皮下注射免疫原1.0 mL，观察14 d，SPF鸡未出现由免疫原引起的任何局部和全身不良反应，表明制备的亚单位免疫原安全性良好。

2.3 精制卵黄抗体AGP效价测定Fiber-2蛋白亚单位免疫原3次免疫商品蛋鸡，蛋黄中C种4型禽腺病毒AGP抗体效价不低于1∶64时收集鸡蛋，按照现有工艺提纯制备精制卵黄抗体，测定制备的精制卵黄抗体的AGP效价为1∶8。

2.4 感染前注射抗体的防治效果

2.4.1临床症状 卵黄抗体预防组和感染对照组SPF鸡感染后连续观察14 d，感染对照组的10只鸡均于感染后3～4 d表现出精神沉郁、羽毛蓬乱、不愿走动、闭眼嗜睡等临床症状，临床症状出现后1～2 d 7只发病鸡死亡；而各卵黄抗体预防组SPF鸡攻毒后14 d内均正常，未出现任何临床症状。

2.4.2剖检结果 感染对照组死亡SPF鸡剖检可见心包积液及肝脏肿大、出血等C种4型禽腺病毒感染的典型病变。各卵黄抗体预防组攻毒后14 d剖检，各脏器均无异常。

该评价结果表明，制备的精制卵黄抗体的预防效果良好，肌肉和皮下途径1 mL/只的注射剂量即可提供不低于7 d的攻毒保护。具体结果如表1所示。

表1 C种 4型禽腺病毒精制卵黄抗体于感染前注射的防治结果

2.5 感染后注射抗体的紧急防治效果

2.5.1临床症状 卵黄抗体预防组和感染对照组SPF鸡感染后连续观察14 d，感染对照组的10只鸡均于感染后3～4 d出现精神沉郁、羽毛蓬乱、不愿走动、闭眼嗜睡等临床症状，临床症状出现后1～2 d其中6只发病鸡死亡；而各卵黄抗体预防组SPF鸡攻毒后，仅1.0 mL/只经皮下注射组的1只SPF鸡于攻毒后3～5 d出现羽毛蓬乱、不愿走动等临床症状，其余组SPF鸡攻毒后14 d内均正常，未出现任何临床症状。

2.5.2剖检结果 感染对照组的10只死亡鸡剖检可见心包积液及肝脏肿大、出血等C种4型禽腺病毒感染的典型病变。各卵黄抗体预防组于攻毒后第14日剖检，各脏器均无异常。

该试验结果表明，SPF鸡感染病毒24 h后，制备的精制卵黄抗体以不低于1.0 mL/只的剂量经皮下或肌肉注射SPF鸡，可以对C种4型禽腺病毒强毒株的攻击提供90%～100%的保护，卵黄抗体的紧急预防效果良好。结果如表2所示。

表2 感染后注射C种4型禽腺病毒卵黄抗体的紧急防治结果

3 讨论

禽腺病毒是全球家禽和野禽常见的传染病病原[10]。多数禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状；在混合感染时，禽腺病毒可成为条件性病原，禽腺病毒作为原发病原，可引起火鸡出血性肠炎，鹌鹑支气管炎和产蛋下降综合征等[11]。禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个亚群，Ⅱ、Ⅲ亚群分别可引起火鸡出血性肠炎和产蛋下降综合征[12]，Ⅰ群禽腺病毒分为A～E 5个种和12个血清型[13]。大多数Ⅰ群腺病毒的致病性还未完全明确，不同血清型的致病性有较大差异[14]。Ⅰ群禽腺病毒的Fiber-2蛋白在介导禽腺病毒感染及致病中具有重要作用，且能有效刺激机体产生体液免疫反应，诱导中和抗体的产生，是制备亚单位免疫原合适的免疫原[15-16]。

近几年来，由C种4型禽腺病毒引起的“心包积液-肝炎综合征”给我国养禽业造成了巨大经济损失，已成为危害养禽业的主要疫病之一[17-21]。目前该病的药物预防效果不佳，通过注射高免卵黄抗体进行预防成为目前防控C种4型禽腺病毒流行较为理想的有效手段，高免卵黄抗体已广泛应用于多种疾病的防治，且化学性质稳定，价格低廉，临床应用效果良好[22-24]。因此，C种4型禽腺病毒精制卵黄抗体的研究具有重要意义。

目前已知的C种4型禽腺病毒精制卵黄抗体制备的免疫原多为鸡胚毒、组织毒或细胞毒，制备的抗原含量较低，成分复杂，且存在着灭活不完全造成散毒的生物安全风险。亚单位免疫原具备免疫原性良好、安全性高的优点，因此以Fiber-2蛋白研制亚单位免疫原进行卵黄抗体的制备具有良好的应用效果和前景。

本研究通过对C种4型禽腺病毒Fiber-2蛋白进行表达与纯化，获得蛋白纯度及AGP效价较高的Fiber-2蛋白液，进一步制备抗原含量高且安全有效的C种4型禽腺病毒亚单位免疫原，免疫产蛋鸡，并通过卵黄抗体提纯制备C种4型禽腺病毒精制卵黄抗体。通过常规预防和紧急预防2种方式评价制备的卵黄抗体的应用效果，研究结果显示，制备的精制卵黄抗体以1.0 mL/只的免疫剂量，采用肌肉或皮下的注射方式在免疫后至少7 d内均能完全保护SPF鸡免受C种4型禽腺病毒强毒株的攻击；且SPF鸡在感染病毒后24 h内，以不低于1.0 mL/只的免疫剂量进行紧急预防，可为SPF鸡提供90%～100%的保护，免疫效果切实有效。本研究为禽腺病毒病的临床防控提供了安全、快速有效的技术手段，且为后续精制卵黄抗体的应用研究及规模化生产工艺奠定基础。