重组猪GM-CSF提高非洲猪瘟病毒在骨髓细胞中的产量

岳慧贤,张艳艳,陈 腾,杨金金,杨金梅,郭晓盼,张 菲,张守峰,王 颖,韩 栒,扈荣良

(军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所,吉林 长春 130122)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的家猪和野猪的烈性传染病。2018年8月初，非洲猪瘟疫情传入我国并迅速传播，防控形势十分严峻。由于该病给我国的养猪业造成了巨大的经济损失，在我国目前客观条件下，开发安全可靠的疫苗已成为防控的关键。研究中的非洲猪瘟疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等[1]，其中减毒活疫苗是目前效果最好的候选疫苗。在减毒活疫苗生产工艺研究中，减毒株的培养及病毒滴度的提高是其中关键。

据报道，尽管重组ASFV可在某些传代细胞系复制，但均无法进行连续稳定传代和高滴度培养增殖。原代肺泡巨噬细胞和骨髓细胞是目前用来分离和培养ASFV的主要培养介质[1,2]。我们在原代细胞的分离培养过程中发现，即使是SPF猪，因呼吸系统处于开放状态，其肺泡巨噬细胞的微生物污染情况仍较为严重，存在如猪4型腺病毒、支原体、圆环病毒等污染。相对而言，骨髓处于生理封闭状态，细胞病原体污染轻微，是目前疫苗生产中培养ASFV的理想选择，但以未分化骨髓细胞培养ASFV时，病毒滴度较低，导致实际免疫成本过高。由于ASFV对髓系来源的单核-巨噬细胞(单核细胞、巨噬细胞以及树突状细胞)易感性最强[3]，因而，本研究拟诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞或树突状细胞，以提高病毒滴度，优化疫苗生产工艺。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)介导细胞增殖和存活的各种信号，在诱导造血干细胞前体集落分化成粒细胞和巨噬细胞方面具有重要作用[4]。在猪骨髓细胞培养分化相关研究中，重组猪GM-CSF(rpGM-CSF)被广泛用以诱导生成骨髓巨噬细胞( bone marrow-derived macrophages,BMDMs )和骨髓树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)[5-6]。我们以市售进口rpGM-CSF(R&D公司)进行相关试验也证实可行，但市售产品价格昂贵，供货期长且国内缺乏稳定供应，给疫苗生产带来不可控风险。鉴于rpGM-CSF诱导分化后的猪骨髓源细胞对ASFV感染和增殖能力影响尚无详细报道，为完善和优化非洲猪瘟疫苗生产工艺，本研究对构建和表达了重组猪GM-CSF，并对其促进骨髓细胞分化，进而提高ASFV培养滴度的特性进行了初步研究，旨在通过自主研发为非洲猪瘟疫苗生产提供稳定可靠的重组猪GM-CSF。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株和载体 大肠埃希菌DH5α、Rosetta(DE3)；原核表达载体pET32a均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2猪或猪肋骨 采集新出生2 h内尚未吸吮初乳的仔猪，采用乙醚吸入麻醉的方式实施安乐死。立即剖检，无菌操作采取肋骨，置灭菌保温盘内，在生物安全柜内进行骨髓细胞冲洗。

1.1.3骨髓细胞 用注射器吸取骨髓冲洗液(RPMI 1640+5 mmol/L EDTA)，将无菌采集的新生仔猪肋骨固定后，将冲洗液注入骨髓内，冲洗出骨髓细胞，经纱布、细胞筛过滤后，1 400 r/min离心5 min,弃去上清，用5倍体积的红细胞裂解液重悬，静置3 min，用30 mL PBS终止反应，1 400 r/min离心5 min，重复裂解，直至红细胞裂解完全，弃上清，用细胞洗涤液1(1×PBS+5 mmol/L EDTA)重悬，静置5 min，1 400 r/min，4℃离心5 min。再使用细胞洗涤液II (1×PBS+2% FBS)重悬，静置5 min，1 400 r/min,4℃离心5 min。使用洗涤液2重复洗涤3次，弃上清，用40 mL RPMI 1640重悬，取100 μL细胞重悬液100倍稀释进行细胞计数。

1.1.4病毒 ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v),带红色荧光标签，由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所保存。

1.1.5主要试剂 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；预染蛋白质Marker购自Thermo；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；蛋白预装柱Histrap hp购自GE lifeEA； IPTG购自宝生物工程(大连)有限公司；RPMI 1640细胞培养基购自Gibico公司；胎牛血清(FBS)购自北京四叶青公司；市售进口rpGM-CSF因子购自R&D公司。

1.1.6主要设备设施 P3实验室，为军事兽医研究所认证通过，Jun ABSL3-004(号)；荧光显微镜Olympus IX73。

1.2 方法

1.2.1重组大肠杆菌pGM-CSF的构建及表达 参照NCBI公布的GM-CSF基因序列(Gene ID:397208)设计引物并构建重组质粒pET32a::pGM-CSF。引物由吉林库美生物有限公司合成，pGM-CSF P1:ATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTCC；pGM-CSF P2:TTACTTTTTGACTGGCCCCCA-GCAG。

将重组的pET32a::pGM-CSF转化入感受态细胞Rosetta (DE3)；经鉴定正确后，将 Rosetta pET32a::pGM-CSF 与空载对照Rosetta pET32a接种于LB + Amp液体培养基中，待细菌D600的值达到0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L 的IPTG诱导2 h。测各菌液的D600值，各取1D600的菌液，收集菌体，用100 μL的1×protein loading buffer 重悬菌体，煮沸10 min。将样品进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白是否表达。

1.2.2重组GM-CSF蛋白的纯化和鉴定 用500 mL LB液体培养基诱导表达pGM-CSF蛋白，12 000 r/min离心20 min收集菌体；加入含8 mol/L尿素的平衡缓冲液重悬后，超声破碎取上清，经蛋白预装柱Histrap hp纯化蛋白，收集洗脱液，通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯化产物。 将诱导后的空载Rosetta pET32a、重组表达菌Rosetta pET32a::pGM-CSF、纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜上，并以5%脱脂乳封闭，利用HRP标记的His标签单抗验证表达的重组蛋白是否带有His标签以便后续纯化。

1.2.3重组GM-CSF(rpGM-CSF)对骨髓细胞分化的影响 无菌操作取新生仔猪的肋骨，用注射器吸取骨髓冲洗液(RPMI 1640+5 mmol/L EDTA)冲洗出骨髓细胞；经纱布、细胞筛过滤后，1 400 r/min离心5 min,弃去上清，用5倍体积的红细胞裂解液重悬，静置3 min，用30 mL PBS终止反应，1 400 r/min离心5min；重复裂解，直至红细胞裂解完全；弃上清，用细胞洗涤液1(1×PBS+5 mmol/L EDTA)重悬，静置5 min，1 400 r/min，4℃离心5 min；再使用细胞洗涤液II (1×PBS+2% FBS)重悬，静置5 min，1 400 r/min,4℃离心5 min；使用洗涤液2重复洗涤3次；弃上清，用RPMI 1640+10%FBS +10 μg/L rpGM-CSF +1×PBS培养基重悬，取100 μL细胞悬液100倍稀释，进行细胞计数；2×107个细胞/90 mm 皿，每个皿培养液体积为12 mL,5个皿作为1个试验组；用RPMI 1640+10%FBS +10 μg/L rpGM-CSF +1×PBS培养基重悬细胞，2×106个细胞/90 mm 皿，5个皿作为空白对照组；将细胞培养皿置于二氧化碳培养箱，37℃培养7 d。

培养后的骨髓源细胞，试验组与对照组分别接入1%的ASFV，在二氧化碳培养箱37℃培养96 h。分别在12,24,48,72和96 h用荧光显微镜下观察细胞的感染情况并拍照。

为了比较本表达产物和市售进口产品的诱导分化效果，将两者按照如上方法进行效果比较。

1.2.4ASFV缺失株的生长曲线及TCID50测定 为了解ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)在本表达产物诱导后的骨髓源细胞上的复制能力。将ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)按照1%的浓度感染本表达产物诱导分化后的骨髓源细胞，并分别于病毒感染后12,24,48,72和96 h收集细胞。冻融2次后，利用猪肺泡巨噬细胞(PAM)做病毒滴度测定，绘制生长曲线。

为比较本表达产物和市售进口产品诱导分化细胞后对病毒培养滴度的影响，分别用两者诱导的细胞培养ASFV缺失株(SY18ΔMGF/CD2v)培养96 h 后收集细胞，冻融2次后按照10倍系列稀释，取10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8共6个稀释度接种至铺有PAM的96孔细胞板，100 μL/孔，同时设阴性细胞对照8孔。96孔培养板置于37℃培养4～5 d 后，观察荧光，用Reed-Muench法计算半数细胞感染量(TCID50)。

2 结果

2.1 重组质粒的构建与诱导表达重组质粒pET32a::pGM-CSF经PCR鉴定后，将空质粒Rosetta pET32a、重组质粒Rosetta pET32a-pGM-CSF转化入表达菌Rosetta中，经终浓度1.0 mmol/L 的IPTG诱导2 h，pGM-CSF蛋白成功表达，目的蛋白的大小约为38 kDa(其中载体标签Trx、 His-tag及S-tag的总大小约为23 kDa，目的蛋白为14.4 kDa),结果见图1。结果表明，诱导表达的重组蛋白pGM-CSF约在38 kDa处出现特异性条带，而空载体在同一位置处未出现任何条带，表明重组蛋白得到正确表达。

M.蛋白质 Marker；1.Rosetta pET32a；2.Rosetta pET32a::pGM-CSF

2.2 重组pGM-CSF蛋白的纯化及Western blot分析诱导表达的菌体离心后，用PBS将菌体重悬，进行超声破碎，分别对上清和包涵体进行处理，经SDS-PAGE电泳分析，包涵体均在38 kDa有明显条带，符合预期条带大小；利用pGM-CSF蛋白上的组氨酸标签经亲和层析法得到纯化的pGM-CSF蛋白。结果显示，当包涵体经过洗涤后除去大部分杂蛋白，重组蛋白纯度可达90%以上。纯化后的蛋白进行透析复性，如图2所示，在38 kDa处出现明显的条带。再将诱导表达的Rosetta pET32a、重组表达菌Rosetta pET32a::pGM-CSF、纯化的重组蛋白pGM-CSF 经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维膜上，进行Western blot 分析。用His单抗做一抗，检测到在相同的位置可见特异性条带，符合预期大小，如图3所示。

M.蛋白质 Marker;1.Rosetta pET32a::pGM-CSF;2.Rosetta pET32a::pGM-CSF;3.纯化的重组蛋白

M.蛋白质Marker;1.Rosetta pET32a::pGM-CSF;2.Rosetta pET32a::pGM-CSF;3.纯化的重组蛋白

2.3 重组pGM-CSF蛋白对骨髓源细胞分化的影响将骨髓源细胞在含有10 μg/L rpGM-CSF的培养基培养7 d后，用显微镜观察在骨髓源细胞的分化情况。发现培养后的骨髓源细胞主要分为贴壁与漂浮细胞，其中贴壁细胞约占30%，而漂浮细胞约占70%。而在贴壁的细胞中主要呈现类似巨噬细胞的“煎蛋状”或球形形态(图4)；非贴壁细胞中大部分细胞呈现出树突状形态，还有一部分细胞形态较小、圆形的未成熟骨髓源前体细胞和粒细胞。同样用10 μg/L进口的rpGM-CSF做了诱导7 d后，细胞的分化情况与本研究表达的rpGM-CSF产生的诱导效果差别不明显。

A.巨噬细胞形态黏附细胞;B.树突状细胞黏附细胞

本研究体外培养试验中，骨髓源细胞添加10,20,50和100 μg/L等不同质量浓度的rpGM-CSF培养7 d后，观察细胞的分化情况。试验可见添加10,20和50 μg/L等质量浓度的rpGM-CSF时，贴壁细胞的数量没有显著的提高，漂浮细胞数量变化不大；而当rpGM-CSF质量浓度提升至100 μg/L时，培养基中的贴壁细胞数量约为55%，非贴壁细胞数量也较多。表明，不同质量浓度的rpGM-CSF对骨髓源细胞分化有较大的影响。

2.4 rpGM-CSF诱导后对病毒增殖的影响将培养7 d的对照组与试验组分别按1%的接毒量接入ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)，分别观察12，24，48，72和96 h等5个时间点接毒后的细胞。光学显微镜下可见，细胞变大变圆类似空泡状或呈葡萄串状，贴壁细胞逐渐脱落；在荧光显微镜下可见，与空白对照组培养基中红色荧光数相比，加有rpGM-CSF的培养基明显增多(图5)。分别收集以上不同时间点的培养物，用生长曲线分析对照组与试验组的感染性。进一步通过细胞培养基中的病毒滴度来测定对照组和试验组的病毒复制能力。表明，与对照组相比rpGM-CSF诱导的试验组的感染力在不同时间段均较强(图6)。通过病毒滴度测定，试验组的病毒滴度约是对照组的0.5～1.5个数量级。

图5 ASFV缺失毒在rpGM-CSF诱导的BMDM中的增殖分析

A.ASFV株在rpGM-CSF培养的骨髓源细胞中的生长曲线;B.不同浓度rpGM-CSF诱导BMDM时ASFV的TCID50

鉴于不同浓度的rpGM-CSF诱导后细胞分化程度不同，病毒的增殖可能会受影响。因此，我们针对10，20和50 μg/L等不同质量浓度rpGM-CSF诱导的细胞进行了TCID50测定，病毒滴度为7.5～7.75 TCID50/mL；而100 μg/L质量浓度的rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞培养ASFV缺失病毒(SY18ΔMGF/CD2v)其病毒滴度为8.0～8.25 TCID50/mL。用上述相同的培养方法，进口rpGM-CSF培养后的病毒滴度为6.8～7.25 TCID50/mL。综上可见，本研究rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞对提升ASFV培养滴度具有明显的作用。

针对本研究制备的rpGM-CSF和进口市售产品在诱导骨髓细胞分化及病毒滴度的比较结果见表1。

表1 rpGM-CSF和进口产品在诱导骨髓细胞分化及病毒滴度的比较结果

3 讨论

本研究设计并人工合成了pGM-CSF基因序列，诱导、表达并纯化了该蛋白,比较了相同培养条件下的骨髓细胞与用rpGM-CSF诱导的骨髓细胞的分化情况。结果表明，rpGM-CSF诱导后的细胞分化程度良好，细胞培养的病毒滴度显著高于未诱导的骨髓细胞。这对ASFV骨髓原代细胞培养和相关疫苗的研究提供了重要工具。

截至目前，已有多个文献报道过用各种细胞细胞因子培养猪骨髓巨噬细胞、DC细胞的方法，如人GM-CSF、小鼠M-CSF、rpGM-CSF等[5,7-8]。本研究用10 μg/L的 rpGM-CSF培养骨髓源细胞7 d后，细胞体积变大变圆，贴壁细胞多数具有巨噬细胞典型特征、贴壁漂浮细胞主要以DC细胞为典型形态。这一试验结果与KIM 等[6]的研究结果一致，rpGM-CSF培养的猪骨髓源细胞中漂浮细胞大部分为DC细胞，贴壁细胞主要是巨噬细胞。YI等[4]的研究表明，高炎性环境培养的骨髓源细胞可能更倾向于分化为巨噬细胞。本研究发现，低质量浓度rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞，贴壁细胞数量并没有明显增加；当质量浓度提高至100 μg/L时细胞贴壁数量显著增加，约是低质量浓度诱导条件的2倍，这些贴壁细胞中约70%具有骨髓巨噬细胞的典型形态，这表明高浓度rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞更倾向于分化成骨髓巨噬细胞。

本研究在构建表达载体时，携带了载体标签Trx、S-tag及His-tag，融合蛋白的大小达38 kDa，而目的蛋白pGM-CSF的分子量为14.4 kDa，标签蛋白的分子量达23 kDa。但从其在细胞培养中生物活性以及和进口产品的效果比较来看，标签蛋白没有影响rpGM-CSF的活性。因此，考虑到体外应用，本研究没有对其作进一步纯化和活性的进一步研究。

ASFV不仅能感染骨髓系单核细胞、巨噬细胞，也能感染DC细胞[9]，但对rpGM-CSF培养的骨髓源细胞对重组ASFV缺失株的病毒增殖能力鲜有报道。本研究通过生长曲线分析发现，rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞在任一时间点对ASFV的感染能力都强于未诱导的骨髓源细胞，且该培养基中的病毒滴度是未诱导的3～30倍，初步表明骨髓细胞的分化程度能影响ASFV的病毒增殖能力；试验进一步发现， ASFV在低浓度rpGM-CSF诱导的培养基中病毒滴度相差不大；而高浓度rpGM-CSF诱导的细胞，其病毒滴度8.0～8.25 TCID50/mL。这表明，高度炎性条件下分化的骨髓源细胞对ASFV的感染能力较强，而原因可能与rpGM-CSF诱导后细胞的贴壁数量、细胞的成熟程度有关。一方面高浓度rpGM-CSF诱导的骨髓源细胞倾向于分化为骨髓巨噬细胞，而骨髓巨噬细胞是ASFV主要靶细胞，因而病毒在该培养基的增殖能力可能更强；另一方面成熟的DC细胞对ASFV的易感性较强；高浓度rpGM-CSF培养骨髓源细胞后可能分化为更多成熟的骨髓DC细胞。

本研究结果表明，骨髓源细胞经rpGM-CSF诱导后分化良好，且能使重组ASFV缺失株有较高效率的增殖，这为ASFV的深入研究提供了重要的工具；且与价格昂贵的进口rpGM-CSF相比，本研究表达的rpGM-CSF为非洲猪瘟疫苗大规模工业生产节省了巨大成本。