宿主细胞的脂筏在问号钩端螺旋体的进入和存活中起关键作用

吕天宝，王佳琪，谢旭峰，宋 宁，关钰颖，吴殿君，张文龙，曹永国

(吉林大学 动物医学学院， 吉林 长春 130062)

钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体(钩体)引起的，除南极洲以外世界范围内广泛存在的人兽共患病[1]。钩体是一种专性需氧的革兰阴性细菌，可分为非致病性和致病性两大类，呈螺旋形，长6～20 μm，直径约0.1 μm[1]。钩体通过擦伤、割伤或直接穿过正常的皮肤和黏膜进入人体，然后进入血管并通过血流到达全身组织器官，最终定居在肾脏，钩体经患病动物或人的尿液排出，污染水源和土壤，人和动物可因直接或间接接触被污染的水和土壤而感染[2]。不同的动物感染不同血清型钩体表现出不同的临床症状，从轻度的流感样疾病到严重的感染，包括肾和肝衰竭，肺部疾病和死亡。典型症状为黄疸，典型病理变化为肺出血[1]。迄今为止，有关钩体入胞机制尚未被阐明。

脂筏是质膜中功能性的纳米级膜结构域，富含胆固醇和鞘脂，其中包含多种信号传导和转运蛋白[3]。越来越多的病原体(包括细菌、病毒和寄生虫等)如大肠埃希菌、假单胞菌、衣原体和A型流感病毒等，已被证明其侵入宿主细胞需要脂筏[4-7]。例如，SEVEAU等[8]发现钙黏蛋白和InlB-HGF-R/Met介导的单核细胞增生性李斯特菌进入细胞需要脂筏结构的完整性。但是，钩体进入细胞是否与脂筏相关尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 细菌和细胞致病性问号钩端螺旋体赖型赖株(56601)、鼠巨噬细胞细胞系(J774A.1，ATCC编号TIB-67)和非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞，ATCC编号CCL-81)由本实验室保存。

1.2 主要仪器与试剂CO2细胞培养恒温箱购自日本三洋公司；暗视野显微镜购自德国奥林巴斯公司；Petroff-Hauser细菌计数板购自美国托马斯公司；共聚焦显微镜购自德国奥林巴斯公司；通用型电泳仪购自美国Bio-Red公司；DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；荧光定量试剂盒购自美国罗氏公司；LC3B、LAMP-1和Caveolin-1抗体购自美国Abcam公司；β-actin以及各种二抗购自美国Immunoway公司；MβCD和胆固醇购自美国Sigma公司；3MA和雷帕霉素购自中国瀚香生物科技有限公司；Lipofectamine RNAiMAX试剂购自美国Invitrogen公司；Cav-1 siRNA购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 细胞与细菌培养致病性问号钩端螺旋体赖型赖株(56601)在29℃的Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris(EMJH)液体培养基中培养，通过感染金黄地鼠保持毒力。对于所有细胞试验，钩体在液体EMJH培养基中的传代次数少于3次。J774A.1和Vero细胞分别培养在含有10%和2%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.4 细胞毒性试验将J774A.1细胞以5×103/孔的密度接种在96孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的MβCD作用30 min后，用CCK8试剂盒检测细胞毒性。

1.5 细胞处理与感染将J774A.1细胞和Vero细胞以1×106个/孔的密度接种在6孔板中，在完全培养基中预孵育12 h。将细胞分为3组：对照组、MβCD组和MβCD+胆固醇组，然后将MβCD组在含有(10 mmol/L)MβCD的RPMI 1640培养基中于37℃孵育30 min，MβCD+胆固醇组在含有10 mmol/L MβCD的RPMI 1640培养基中处理30 min 后再在含200 mg/L胆固醇的RPMI 1640培养基中37℃孵育30 min。用PBS洗涤后，3组细胞以1∶100的剂量感染致病性菌株56601。将细胞在5% CO2中于37℃孵育40 min，用PBS洗涤，经胰蛋白酶消化的离心(1 200 r/min)收集细胞，使用DNA提取试剂盒提取DNA以测量胞内钩体量。

将J774A.1细胞以1×106个/孔的密度接种在6孔板中，12 h后以1∶100的比例感染钩体，同时加入3MA(10 mmol/L)或雷帕霉素(50 mg/L)，2 h后收集细胞，用1 mL蒸馏水裂解细胞，吸取100 μL裂解液加入到3 mL EMJH培养基中，29℃培养箱中恒温培养4～6 d，在暗视野显微镜下用Petroff-Hauser细菌计数板计数。

1.6 小窝蛋白(Cav-1)的小RNA干扰试验使用Lipofectamine RNAiMAX试剂将siRNA转染到J774A.1细胞中，并在24 h后对Cav-1进行免疫荧光染色，对细胞进行钩体感染试验。

1.7 实时荧光定量PCR根据致病性钩体特异性基因LipL32设计引物[9]，对胞内钩体进行荧光定量PCR分析(绝对定量)，使用体外培养细菌中提取的DNA的梯度稀释液(109～102)制备标准曲线，测定钩体量。

1.8 激光共聚焦显微镜将多聚赖氨酸处理过的12 mm细胞爬片置于24孔板中，以2×105个/孔的数量接种细胞，待细胞贴壁后，将细胞分为对照组和MβCD组，分别处理后，以1∶100的比例感染钩体，感染40 min后，吸去上清，用预冷的PBS清理3次，加4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次后，以含2% BSA的PBS溶液室温封闭30 min，用抗钩体一抗室温孵育30 min，PBS清洗3次后，用FITC标记的荧光二抗室温孵育30 min，对细胞外的钩体进行荧光染色。PBS清洗3次后，用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室温处理10 min，PBS清洗1次后再用含2% BSA的PBS溶液室温封闭30 min，用抗钩体一抗室温孵育30 min，PBS清洗3次后，用TRITC荧光二抗室温孵育30 min，对胞内钩体进行荧光染色。用PBS清洗3次后，用Hoechst染色5 min，清洗3次后将细胞爬片以甘油黏附到载玻片上，置于共聚焦显微镜下观察。

1.9 Western blot将J774A.1细胞以1×106个/孔的密度接种在6孔板中，并在完全培养基中预孵育12 h。将细胞分为4组：对照组、MβCD组、钩体组和MβCD+钩体组。用MβCD刺激30 min后感染细胞，于感染后4 h收集细胞，用预冷的PBS缓冲液清洗3遍，用蛋白提取试剂裂解细胞10 min，然后用超速离心机以4℃ 12 000 r/min离心10 min收集上清液，使用BCA法检测蛋白浓度。调整蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液，100℃加热8 min使蛋白变性，配置15% SDS-PAGE浓缩胶以及分离胶，以30 μg/孔蛋白量上样，80 V电泳20 min后转用120 V 电泳1 h，然后通过湿转法将蛋白转至PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，用相应的一抗在4℃环境下孵育过夜，用TBST溶液清洗3次后，常温下用二抗孵育2 h，用TBST溶液清洗3次后即可在显影仪下检测蛋白量。

2 结果

2.1 钩体进入细胞需要脂筏介导免疫荧光和Western blot结果表明，MβCD和Cav-1 siRNA都能破坏细胞的脂筏结构(图1)，并且，细胞毒性试验分析表明MβCD对细胞没有潜在的毒性(图2)。因此，MβCD和Cav-1 siRNA能够用做脂筏破坏的试剂进行接下来的试验。

A.MβCD(10 mmol/L)刺激细胞30 min以及Cav-1 siRNA(100 nmol/L)刺激细胞24 h后，对细胞小窝蛋白的荧光染色,其中每个样品至少随机拍摄10张不同部位的图片，图中展示了各组代表性结果(×400)；B.Western blot检测Cav-1 siRNA的沉默效果，试验重复3次

以不同浓度MβCD处理J774A.1细胞30 min，然后用CCK8试剂盒检测细胞毒性。ns表示P>0.05，无显著性差异

用qPCR检测细胞内的钩体量，结果表明，用MβCD破坏脂筏后，进入J774A.1细胞内的钩体量明显降低，用胆固醇回补脂筏后，胞内钩体量有所升高(图3A),证明钩体进入细胞需要脂筏。为了验证这个现象，采用了小RNA干扰技术，敲低了细胞的小窝蛋白，结果表明，敲低细胞的小窝蛋白后，进入J774A.1细胞的钩体量明显降低(图3C)。在Vero细胞的试验中，也发现了同样的现象，即用MβCD破坏脂筏后，细胞内的钩体量明显降低，用胆固醇回补脂筏后，胞内钩体量有所升高(图3B)。激光共聚焦结果直观地表明，脂筏被破坏后，胞内的钩体量明显减少(图3D)。

A,B.J774A.1和Vero细胞在正常状态，MβCD破坏脂筏的状态以及胆固醇回补状态下，钩体进入细胞的数量的检测，试验重复3次；C.J774A.1细胞在正常状态以及Cav-1 siRNA破坏脂筏的状态下，进入细胞的钩体数量检测，试验重复3次；D.激光共聚焦显微镜下观察胞内外钩体的荧光染色结果(×1 000)。*表示P<0.05，显示有显著性差异；**表示P<0.01，显示有非常极显著性差异；***表示P<0.001，显示有极显著性差异。下同

2.2 脂筏影响胞内钩体的存活透射电子显微镜下观察在有无脂筏的情况下钩体进入细胞的情况，结果显示在感染后40 min，破坏脂筏结构的J774A.1细胞(图4E)比正常细胞(图4B)中的钩体量明显较少。在感染后4 h，正常细胞中还有大量钩体，其形态学结构无明显改变(图4C)，但是在脂筏被破坏的细胞中，感染后4 h的胞内钩体基本被杀死，并且形态学结构模糊(图4F)。另外，通过qPCR检测了感染后4 h的胞内钩体量，结果表明，与正常组相比，脂筏被破坏后，细胞杀灭钩体的能力增强(图4G)。此外，液体培养基分离培养试验也证明了脂筏被破坏后，细胞杀灭钩体的能力增强(图4H)。

A.透射电子显微镜下，正常状态下J774A.1细胞图；B.正常J774A.1细胞感染后40 min胞内钩体的情况；C.正常J774A.1细胞感染后4 h胞内钩体的情况；D.脂筏破坏后的J774A.1细胞图；E.脂筏破坏后，J774A.1细胞感染后40 min胞内钩体的情况；F.脂筏破坏后，J774A.1细胞感染后4 h胞内钩体的情况；G.qPCR检测感染后40 min以及4 h J774A.1细胞在有无脂筏状态下胞内的钩体量，试验重复3次；H.液体培养基培养计数结果表示感染后40 min以及4 h J774A.1细胞在有无脂筏状态下胞内存活的钩体量，试验重复3次。

2.3 破坏脂筏增强了钩体感染引起的细胞自噬水平Western blot结果表明，用MβCD破坏脂筏后，J774A.1细胞LC3-Ⅱ蛋白的水平明显增高，溶酶体标记性蛋白LAMP-1的水平也明显增高(图5A)。并且，在感染钩体后，与对照组相比，脂筏破坏组的LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的水平明显较高。证明脂筏被破坏，感染钩体后，细胞的自噬水平明显增强(图5A)。另一方面，用自噬的抑制剂(3MA)和激活剂(雷帕霉素)分别刺激感染钩体的J774A.1细胞，用液体培养基培养计数方法测定胞内钩体量，结果表明，用雷帕霉素激活细胞自噬后，胞内存活的钩体明显较少(图5B)。由以上结果可知，破坏脂筏可以增强细胞自噬水平，自噬水平的增强有助于细胞杀灭胞内的钩体。

A.脂筏完整和被破坏状态下感染钩体后4 h的自噬标记分子蛋白免疫印迹图以及LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的相对表达水平，试验重复3次；B.3MA和雷帕霉素分别刺激细胞后，用液体培养基培养计数测得细胞内存活的钩体量

3 讨论

钩体为非专性细胞内寄生菌，能够在哺乳动物细胞内转运而不损坏细胞的功能。钩体通过人或动物破损的皮肤或黏膜进入体内，随血流遍布全身组织器官。敏感动物感染后急性死亡，耐受动物发展成慢性肾脏疾病，其肾脏中有大量钩体定殖，并随尿液排出，污染土壤和水源，严重威胁着社会公共卫生安全[10]。我国农业部第1125号公告也将钩体病列为我国二类动物疫病，第1149号公告将其列入人兽共患传染病名录。但是，钩体进入细胞的机制以及其在胞内移行及胞间的穿行机制还未被阐明。

脂筏是脂膜上富含鞘磷脂和胆固醇的微结构域，其包含多种信号转导蛋白和转运蛋白，例如小窝蛋白[11-12]。越来越多的病原体，例如大肠埃希菌、假单胞菌、衣原体和A型流感病毒等，已被证明其侵入宿主细胞需要脂筏[4-7]。因此，需要探究脂筏是否在钩体入胞过程中发挥作用。

试验证明MβCD对细胞无毒性，并且免疫荧光结果表明，J774A.1细胞在MβCD作用30 min后，脂筏的标志性蛋白小窝蛋白1(Caveolin-1)的表达明显降低，因此，参照之前的研究[13-14]，采用MβCD破坏细胞的脂筏结构。与对照组相比，在对J774A.1细胞进行脂筏结构的破坏后，进入细胞的钩体量明显降低，用胆固醇回补脂筏结构，发现胞内的钩体量有所升高，证明钩体进入J774A.1细胞需要脂筏。为了避免单一药物的偶然性，用小RNA干扰技术敲低细胞Cav-1的表达[15]，结果表明，Cav-1的表达降低后，进入细胞的钩体量同样减少，再次验证了钩体进入细胞需要脂筏。为了验证这个现象是否与细胞类型有关，用Vero细胞重复了同样的试验，结果也表明钩体进入细胞对脂筏的依赖性。另外，激光共聚焦显微镜的观察结果更直观地显示这一现象。这些结果共同表明钩体进入细胞需要脂筏，当脂筏结构的完整性被破坏后，钩体进入细胞的能力明显降低，并且，这个现象与巨噬细胞的主动吞噬作用无关。这种对脂筏的依赖性在单核细胞增生性李斯特杆菌和猪流行性腹泻病毒的入胞过程中同样被证实[8,16]。

接下来，通过透射电子显微镜观察J774A.1细胞在有无脂筏结构的情况下感染后40 min及感染4 h后胞内钩体的数量和形态。结果表明，在感染后40 min，破坏脂筏结构的J774A.1细胞内的钩体量明显减少；在感染后4 h，对照组胞内仍有大量钩体，并且其形态完整，而脂筏破坏组胞内的钩体基本消失，形态模糊。从胞内钩体全菌荧光定量和活菌的液态培养基培养计数结果可知，在感染后4 h，脂筏破坏组胞内的钩体几乎全被清除。这些结果表明破坏脂筏后，细胞杀灭钩体的能力增强。

有研究表明，脂筏AKT-FOXO1途径会影响自噬的调节，脂筏的破坏会诱导自噬[17]。细胞自噬是真核细胞中通过溶酶体降解细胞质成分的过程，同时也具有重要的宿主防御功能。因此，探究中破坏脂筏后，细胞杀灭钩体的能力增强是否与细胞自噬增强有关，结果表明，破坏脂筏能够显著增强细胞LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白表达，证明破坏脂筏能够增强自噬水平以及钩体感染后的自噬水平。因此，细胞自噬水平的升高可能有助于杀灭胞内的钩体。为验证这一猜想，分别用自噬激活剂(雷帕霉素)和自噬抑制剂(3MA)处理钩体感染的J774A.1细胞，液体培养基培养计数结果表明，雷帕霉素能够显著降低胞内钩体量，证明自噬水平的增强有助于杀灭胞内钩体。以上结果表明，破坏细胞脂筏增强了细胞自噬和细胞杀灭钩体的能力。

综上所述，本研究证明钩体进入细胞需要脂筏，在破坏脂筏后，钩体进入细胞的量明显降低，并且细胞杀灭钩体的能力增强，可能的原因是因为破坏脂筏加强了细胞的自噬水平。本研究发现钩体进入细胞与脂筏结构的完整性相关，为钩体病预防产品的研发提供理论依据。