鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的安全性和有效性

刘月月，侯瑞卿，张盼涛，段佳蕾，王同燕，郭丽霞，盛东北，袁 月，刘武杰*，田克恭*

(1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；2.洛阳惠中生物技术有限公司，河南 洛阳 471000)

鸡新城疫(ND)是由鸡新城疫病毒(NDV)引起的一种烈性传染病，病鸡常常表现为精神沉郁、嗜睡、头颈、尾部节律性震颤，传播迅速、死亡率较高，全世界大部分国家和地区均流行[1-2]。鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的急性呼吸道传染病，所有日龄鸡均可感染，可侵害呼吸道、泌尿生殖道及消化道，可引起肉鸡增重缓慢、蛋鸡产蛋率下降[3-5]。禽流感(AI)亚型众多，是危害我国养禽业的重要疾病，虽然H9亚型禽流感致病力不高，但鸡群感染后往往影响其产蛋性能，且易引发继发感染，加上病毒易变异，使得时常引起鸡群感染[6-14]。这3种疾病对养禽业造成重大经济损失，目前疫苗免疫仍然是预防这3种传染病的重要措施。

研究表明，21世纪以来，基因Ⅶ型NDV已逐渐成为鸡群中的流行优势毒株[15-18]，但目前已经上市的ND相关的灭活疫苗和活疫苗使用的疫苗株多为基因Ⅱ型的La Sota株。疫苗株与流行株之间基因型匹配性关系着疫苗对鸡群的保护效果[19]，因此基因Ⅶ型ND疫苗的研究迫在眉睫。近年来，本研究从临床分离了多株的基因Ⅶ型NDV毒株，其中PLK-N-06株免疫原性好，但毒力强，不宜作为疫苗株直接使用。通过反向遗传技术将PLK-N-06株致弱，获得N7a株疫苗株，前期研究结果显示，N7a株免疫原性好、毒力弱，是理想的疫苗候选株。我们对H9亚型(AIV)进行了持续的流行病学调查，从大量的临床分离株中筛选到1株交叉保护性较好的毒株—A/Chicken/Shandong/SZ/2008(H9N2)株(简称“SZ株”)，可作为理想的疫苗候选株，用于灭活疫苗的研制。

本研究中，我们使用NDV N7a株、H9 AIV SZ株连同IBV经典疫苗株M41株制备的ND、IB、AI(H9亚型)三联灭活疫苗，分别免疫肉鸡和蛋鸡进行安全性和有效性评价。

1 材料与方法

1.1 疫苗鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)由普莱柯生物工程股份有限公司GMP车间生产。

1.2 抗原NDV血凝抑制试验(HI)抗原和AIV H9亚型血凝抑制试验抗原，均由国家兽用药品工程技术研究中心制备；IBV血凝抑制抗原购自荷兰GD公司。

1.3 攻毒用毒株NVD PLK-N-06株和AIV(H9亚型)SZ株，均由国家兽用药品工程技术研究中心制备、鉴定与保存。

1.4 试验动物河南省洛阳市某肉鸡养殖场14日龄AA肉鸡；湖北省荆门市某蛋鸡养殖场210日龄蛋鸡。

1.5 肉鸡安全性和有效性研究14日龄AA肉鸡9700只，颈部皮下免疫三联苗，0.3 mL/只，另设100只不免疫作对照。

1.5.1肉鸡安全性研究 每日观察并记录鸡群的精神、采食、饮水等状况，连续观察14 d。每日随机抽取20 只免疫鸡，观察疫苗注射部位，记录有无硬结、肿胀和溃烂等不良反应，连续观察28 d。于免疫后14 d和出栏当日(免疫后35 d)，从免疫组随机抽取10只，连同对照鸡随机抽取3只剖杀，剖检观察注射部位的疫苗吸收情况。

另外，为研究三联苗对肉鸡生长性能的影响，在疫苗免疫当日、免疫后14 d和出栏当日(免疫后35 d)，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，分别称重，记录结果，并运用SPSS软件对体质量进行统计分析。

1.5.2肉鸡抗体测定 于疫苗免疫当日、免疫后14，21 d和出栏当日，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，采血并分离血清，分别检测ND、IB和AI HI抗体效价，并运用SPSS软件对抗体值进行统计分析。

1.5.3攻毒保护试验 于免疫后21 d，从免疫鸡中各随机抽取20 只，同时从对照鸡中随机抽取10只，等分为2个亚组，每个亚组包含免疫鸡10只、对照鸡5只。第1亚组通过肌肉注射途径进行鸡新城疫病毒PLK-N-06株攻毒，105.0ELD50/只，连续观察14 d，攻毒后第5天采集泄殖腔棉拭子，接种10～11日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。第2亚组通过静脉注射途径进行AI(H9亚型)SZ株攻毒，107.0EID50/只，攻毒后5 d采集喉头和泄殖腔棉拭子，每只鸡2种棉拭子混合后作为1个样品接种10～11 日龄SPF鸡胚，进行病毒分离，并运用SPSS软件对发病率、死亡率和病毒分离阳性率进行统计分析。

1.6 蛋鸡安全性和有效性研究210日龄蛋鸡2 000 只，腿部肌肉注射三联苗，0.5 mL/只，另设500只不免疫作对照。

1.6.1蛋鸡安全性研究 每日观察并记录鸡群的精神、采食、饮水等状况，连续观察14 d。另外，每日从免疫组随机抽取20 只，观察疫苗注射部位，记录有无硬结、肿胀和溃烂等不良反应，连续观察28 d。

另外，为研究三联苗对蛋鸡产蛋性能的影响，从免疫鸡及对照鸡中各抽取500只，记录免前7 d及免疫后每日的产蛋率，连续观察至免疫后14 d。

1.6.2蛋鸡抗体检测 于疫苗免疫当日、免疫后21 d、3和6个月，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV HI 抗体效价，并运用SPSS软件对抗体值进行统计分析。

2 结果

2.1 肉鸡安全性和有效性研究

2.1.1肉鸡安全性研究 免疫鸡与对照鸡于免疫后每日观察至免疫后14 d，各组鸡精神、采食、饮水等均未见异常。另外，每日从免疫组分别随机抽取20 只免疫鸡，观察疫苗注射部位，连续观察至免疫后28 d，结果显示，各免疫鸡注射部位均无硬结、肿胀和溃烂等不良反应。免疫后14 d，免疫组剖检注射部位除均有少量未吸收的疫苗外，无硬结、脓肿和溃烂发生；至出栏当日(免疫后35 d)，免疫组注射部位剖检，疫苗均吸收完全。

于疫苗免疫当日、免疫后14 d和出栏当日(免疫后35 d)，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，分别称体质量。结果详见表1。结果显示，各时间点免疫鸡体质量与对照鸡均无明显差异。

表1 AA肉鸡疫苗免疫前后不同时间点体质量统计结果

2.1.2肉鸡抗体检测 疫苗免疫当日、免疫后14，21 d和出栏当日(免疫后35日)，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价。结果显示，对照组在免疫后抗体效价逐渐降低，至出栏当日降至最低。免疫组免疫后抗体效价逐渐升高，出栏当日升至最高， NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价分别达到了8.8 log2,6.7 log2,9.3 log2，免疫后不同时间免疫组抗体值均显著高于对照组。具体结果见表2、图1。

表2 AA肉鸡疫苗免疫前后不同时间测定的HI抗体效价

A.NDV HI；B.IBV HI；C.H9 AIV HI

2.1.3攻毒保护试验 于免疫后21 d，2组免疫鸡10只，连同对照鸡5只分别进行NDV PLK-N-06株和AIV(H9亚型)SZ株攻毒保护试验。结果显示，NDV攻毒后对照组4/5发病，2/5死亡，3/3病毒分离阳性，AIV(H9亚型)攻毒后对照组病毒分离阳性率为4/5，而免疫组NDV和H9亚型AIV攻毒后均无发病、无死亡、病毒分离阳性率为0/10，表明三联苗能为免疫鸡提供NDV和AIV(H9亚型)完全攻毒保护。

表3 AA肉鸡免疫后21 d攻毒保护结果

2.2 蛋鸡安全性和有效性研究

2.2.1蛋鸡安全性研究 各组免疫鸡与对照鸡于免疫后每日观察至免疫后14 d，结果显示，各组鸡精神、采食、饮水等均未见异常；另外，每日从各免疫组分别随机抽取20 只免疫鸡，观察疫苗注射部位，连续观察至免疫后28 d，结果显示，各免疫鸡注射部位均无硬结、肿胀和溃烂等不良反应发生。

从免疫组及对照组中各观察500只，记录免前7 d及免疫后14 d的产蛋率，连续观察至免疫后14 d。结果显示，免疫前第7天、免疫后第7天、免疫后第14天免疫组产蛋率分别为92.3%，92.3%，92.1%，对照组产蛋率分别为92.2%，92.3%，92.2%。免疫组在免疫前后产蛋率与对照组均无明显差异。

2.2.2蛋鸡抗体检测 于疫苗免疫当日、免疫后21 d、3和6个月，从免疫鸡及对照鸡中各随机抽取20 只，采血并分离血清，分别检测NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价。结果显示，对照组抗体效价逐渐降低，免疫组免疫后21 d，NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价升至最高，分别为11.6 log2，8.9 log2，12.1 log2，而后逐渐下降，但在免疫后6个月仍保持在较高的水平，显著高于对照组。具体结果详见表4、图2。

表4 210日龄蛋鸡免疫前后不同时间HI抗体检测结果

A.NDV HI；B.IBV HI；C.H9 AIV HI

3 讨论

由于ND强毒株作为疫苗株直接使用时存在生物安全风险，可通过基因改造的方法改变毒株的毒力。反向遗传技术被广泛应用于基因改造中，JI等[20]通过反向遗传技术研制出了基因Ⅶ型NDV候选疫苗株，不但能为基因Ⅶ型毒株提供完全保护，还能显著降低机体的排毒量。本研究中所使用的新支流三联灭活苗中鸡新城疫N7a疫苗株亦是通过反向遗传技术致弱而得，MDT和ICPI等毒力指标达到了弱毒株标准，制备的灭活苗能产生良好的保护效力。H9亚型AIV易变异，在我国有多个分支的病毒同时流行，前期研究中，我们从大量临床分离株中筛选了1株免疫原性好、保护谱广的毒株SZ，可作为疫苗株用于灭活疫苗的制备。

本研究使用NDV N7a株、IBV M41株、H9 AIV SZ株制备的新支流三联灭活疫苗在肉鸡和蛋鸡上进行了安全性和有效性研究。安全性结果显示，疫苗免疫肉鸡和蛋鸡后均无任何不良反应，肉鸡出栏时疫苗吸收完全，肉鸡的增重和蛋鸡的产蛋与对照组均无明显差异，疫苗安全性良好。

血清HI抗体与攻毒保护呈正相关，抗体水平直接反应出机体抵抗病原体感染的能力[21-22]。本研究中所使用的肉鸡和蛋鸡在前期均免疫过相关的活苗或灭活苗，故免疫三联苗时体内均有一定水平的抗体。但三联苗免疫后各时间点产生的抗体水平均显著高于对照组，肉鸡免疫后14 d即有明显提升，至出栏时抗体值达到最高，NDV HI、IBV HI、H9 AIV HI分别为8.8 log2,6.7 log2,9.3 log2，而对照组持续降低，至出栏时降至最低。肉鸡免疫后21 d能对NDV和H9 AIV提供完全攻毒保护，对照组未完全发病或排毒，可能是由于攻毒时体内仍有一定水平的抗体。蛋鸡免疫后21 d抗体效价达到最高，NDV HI、IBV HI、H9 AIV HI分别为11.6 log2，8.9 log2，12.1 log2，至免疫后6个月仍能达到较高水平，而对照组持续降低，除免疫当日外，免疫组各抗体效价显著高于对照组。以上结果均表明，三联苗免疫效果好，能有效预防鸡只感染。

本研究中，新支流三联苗在肉鸡和蛋鸡上能产生较好的免疫效力，且安全性良好，实现了一针三防，能大大减少单苗多次免疫造成的应激，降低免疫成本，创造更多的效益。