正交试验优选制洋金花的炮制工艺研究

夏永严 李 娅 秦昆明,3 杨 超 蔡宝昌,3, 金俊杰,3*

1.苏州大学附属张家港医院药剂科，江苏 苏州 215600；2.南京海昌中药集团有限公司，江苏 南京 210061；3.南京海源中药饮片有限公司，江苏 南京 210061；4.南京中医药大学 国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，江苏 南京 210023

洋金花Daturaeflos为茄科植物白花曼陀罗DaturametelL.干燥花，性味辛温、有毒[1]。研究表明洋金花具有麻醉人体中枢神经系统作用，伍玉哲等[2]对87例临床患者进行镇痛研究表明洋金花制剂镇痛明显，故洋金花以“中药麻醉”临床功效而被广泛使用[3]。洋金花具有毒性，内服急性中毒报道6例[4]，多由误服或用量过度所导致，在内服用量上需谨慎[5]。对于洋金花在临床使用有明显镇痛效果，表明其具有临床使用价值，但因其本身具有毒性或临床使用量不精确，临床上解决方法：一方面可以通过控制临床用量，减少其毒性反应出现，另一方面对洋金花进行炮制，达到减毒增效和提高其内在质量稳定性的效果。对制洋金花的炮制工艺进行研究，获得稳定的炮制工艺参数，形成质量均一稳定的制洋金花，有助于制洋金花的临床使用安全有效。

制洋金花只有《上海市中药饮片炮制规范》[6]收载：将生洋金花用生姜汁拌匀，待吸透，略润，切成1～2 mm细丝，置锅内，炒干，趁热喷洒白酒，拌匀，稍闷，晾干(每生洋金花100 kg，用生姜25 kg打汁，60°白酒12.5 kg)。目前，《药典》规定洋金花含量测定成分为东莨菪碱[1]，未有相关文献对制洋金花的炮制工艺优化报道，对于炮制工艺中“将生洋金花用生姜汁拌匀”中生姜汁加水量及之后进行的闷润时间和“置锅内，炒干”中的炒制温度和炒制时间未有明确的参数，为将其更好地用于临床，本课题组对其进行最佳炮制工艺探索。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器)(日本岛津公司)、BP211D型万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、FN1004N型十万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、PHS-3C精密数显台式酸度计PH计(上海雷磁仪器有限公司)、RE-52型旋转蒸发仪(BUCHI)、KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、XL-10B型500g密封型摇摆式高速粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)、SHZ-D(III)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、榨汁机JYZ-D57(九阳)。

1.2 试药 洋金花(产地安徽)和生姜(产地山东)，购自南京海源中药饮片公司，并经南京海源中药饮片有限公司首席质量官执业中药师丁斐鉴定，洋金花Daturaeflos为茄科植物白花曼陀罗DaturametelL.干燥花。氢溴酸东莨菪碱对照品(成都普菲德生物技术有限公司，批号18113008，纯度≥98%)。磷酸钠、十二烷基硫酸钠、磷酸、盐酸、浓氨水、三氯甲烷均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 制洋金花中东莨菪碱含量测定方法的建立[1]

2.1.1 色谱条件 YMC-Pack ODS-A色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.07 mol/L磷酸钠溶液(含0.0175 mol/L十二烷基硫酸钠，用磷酸调节pH值至6.0)(50∶100)为流动相；流速：1 mL·min-1；检测波长为216 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。氢溴酸东莨菪碱对照品和供试品的HPLC图谱如图1所示。

2.1.2 对照品溶液的制备 取氢溴酸东莨菪碱对照品适量，精密称定，加“2.1.1项下”流动相制成每1 mL含0.679 mg的溶液，即得(东莨菪碱重量=氢溴酸东莨菪碱重量/1.445)。

2.1.3 供试品溶液的制备 取制洋金花样品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入2 mol/L盐酸溶液10 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，滤渣和滤器用2 mol/L盐酸溶液10 mL分数次洗涤，合并滤液和洗液，用浓氨试液调节pH值至9，用三氯甲烷振摇提取4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用流动相溶解，转移至5 mL量瓶中，加“2.1.1项下”流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL各置于1 mL容量瓶中，加“2.1.1项下”流动相定容至刻度，摇匀，制得13.58、27.16、40.74、54.32、67.90 μg/mL。分别吸取对照品溶液各10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积值。将所得峰面积(Y)与对照品的浓度(X)进行线性回归，得氢溴酸东莨菪碱回归方程、相关系数(R)及线性范围为Y=12071X+148，R=0.9999，135.8～679 μg/mL。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，连续进样6次，记录氢溴酸东莨菪碱峰面积和保留时间值，并计算RSD值，面积和保留时间RSD值分别为1.18%、0.66%，说明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 于0、2、4、8、12、24 h精密吸取按“2.1.3”项下制备的供试品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，记录氢溴酸东莨菪碱峰面积和保留时间值，计算 RSD值，面积和保留时间RSD值分别为1.77%、1.00%，说明供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

2.1.7 重复性试验 制洋金花样品粉末混合均匀分成6份，按“2.1.3”项下方法制备得供试品溶液，分别吸取10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录氢溴酸东莨菪碱含量和保留时间值，并计算RSD值，氢溴酸东莨菪碱平均含量0.15%，含量和保留时间RSD值分别为1.35%、0.72%，说明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 制洋金花样品粉末9份，每份0.5 g，各加入对照品溶液0.9、0.9、0.9、1.1、1.1、1.1、1.3、1.3、1.3 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在三氯甲烷溶解蒸干后的残渣中用流动相溶解，转移至5 mL量瓶中，加“2.1.1项下”流动相至刻度。按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积值，计算回收率以及RSD值，氢溴酸东莨菪碱平均回收率为103.76%，RSD为1.40%，说明该方法具有良好的准确度，具体见表1。

表1 回收率测定结果 (n=9)

2.2 制洋金花炮制工艺单因素考察

2.2.1 生姜加水量考察 取50 g洋金花样品，生姜用量12.5 g，榨汁机打汁后得到生姜汁10 mL，加水量见生姜打汁后加水量考察表，25 ℃下闷润30 min后切碎，炒制温度190～220 ℃(500 W)，炒制时间5 min，样品的温度降到29～30 ℃时，喷洒60°白酒6.25 g，25 ℃下闷润30 min后晾干。按“2.1”项测定东莨菪碱含量。生姜打汁后加水量考察见表2。由表2可知，生姜打汁后加水量为2倍生姜汁体积的水(20 mL)、3倍生姜汁体积的水(30 mL)、4倍生姜汁体积的水(40 mL)时，东莨菪碱含量较高。

表2 生姜打汁后加水量考察表

2.2.2 闷润时间考察 取50 g洋金花样品，生姜用量12.5 g，榨汁机打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁体积的水(30 mL)，25 ℃下闷润后切碎，闷润时间见闷润时间考察表，炒制温度190～220 ℃(500 W)，炒制时间5 min，样品的温度降到29～30 ℃时，喷洒60°白酒6.25 g，25 ℃下闷润30 min后晾干。按“2.1”项测定东莨菪碱含量。闷润时间考察见表3。由表3可知，闷润时间为30 min、40 min、50 min时，东莨菪碱含量较高。

表3 闷润时间考察表

2.2.3 炒制温度考察 取50 g洋金花样品，生姜用量12.5 g，榨汁机打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁体积的水(30 mL)，25 ℃下闷润30 min后切碎，炒制温度见炒制温度考察表，炒制时间5 min，样品的温度降到29～30 ℃时，喷洒60°白酒6.25 g，25 ℃下闷润30 min后晾干。按“2.1”项测定东莨菪碱含量。炒制温度考察见表4。由表4可知，炒制温度为100～130 ℃、190～220 ℃、270～300 ℃时，东莨菪碱含量较高。

表4 炒制温度考察表

2.2.4 炒制时间的考察 取50 g洋金花样品，生姜用量12.5 g，榨汁机打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁体积的水(30 mL)，25 ℃下闷润30 min后切碎，炒制温度190～220 ℃(500 W)，炒制时间见炒制时间考察表，样品的温度降到29～30 ℃时，喷洒60°白酒6.25 g，25 ℃下闷润30 min后晾干。按“2.1”项测定东莨菪碱含量。炒制时间考察见表5。由表5可知，炒制时间为5 min、6 min、7 min时，东莨菪碱含量较高。

表5 炒制时间考察表

2.3 制洋金花炮制工艺正交试验

2.3.1 正交试验设计 根据单因素试验的结果，取洋金花样品选择生姜打汁后加水量(A)、闷润时间(B)、炒制温度(C)、炒制时间(D)为考察因素，以东莨菪碱含量和水分含量评价为指标，进行正交设计安排实验，因素水平见表6。

表6 因素水平

2.3.2 正交试验结果 采用L9(34)表安排试验，以东莨菪碱含量和水分含量评价为指标，制洋金花中水分测定方法见2015版《中国药典》通则0832第二法[7]。以综合加权评分法来评价，评分方法为东莨菪碱含量占80%，水分含量占20%。东莨菪碱含量和水分含量的满分均为10分，综合评价=东莨菪碱含量/最大的东莨菪碱含量×10×80%+水分含量评价/最大的水分含量评价×10×20%。水分含量评价标准如表7，实验结果见表8，方差分析见表9。

表7 水分含量评价标准

表8 制洋金花L9(34)正交实验结果

表9 方差分析

由方差分析可知，生姜加水量对于制洋金花的炮制工艺具有显著性影响，其影响因素重要性为：生姜打汁后加水量>炒制时间>炒制温度>闷润时间。根据正交试验结果，第5组实验综合评价最高，其中东莨菪碱含量和水分含量评价均为最高值，所以选择第5组实验方法为最优炮制工艺，即取50 g洋金花样品，用生姜12.5 g打汁后加3倍生姜汁体积的水(30 mL)，25 ℃下闷润40 min后切碎，在270～300 ℃下炒制5 min，29～30 ℃下喷洒6.25 g的60°白酒后，25 ℃下闷30 min，晾干。

2.3.3 验证试验 采用确定的最优炮制工艺条件，取洋金花样品进行3次平行试验，计算东莨菪碱含量和水分，3次测定结果均优于正交试验各工艺结果，说明制洋金花的炮制工艺合理可行，结果见表10。

表10 验证试验

3 讨论

生姜加水量范围选择，润透洋金花药材考察得出，低于2倍生姜汁体积的水(20 mL)，洋金花药材没有润湿完全，高于5倍生姜汁体积的水(50 mL)，洋金花药材过于润湿，有滴水现象。对炮制工艺中的喷洒60°白酒进行考察，选取药材温度和喷洒60°白酒后的药材闷润时间进行考察，药材温度过高时喷洒过白酒的药材进行闷润，白酒挥发快，本项炮制工艺消耗时间短，结果酒味淡；药材温度过低时喷洒过白酒药材闷润后，白酒挥发慢，本项炮制工艺消耗时间长，结果酒味浓。本项炮制工艺优选药材温度降到29～30 ℃时，喷洒60°白酒，25 ℃下闷润30 min后晾干，使炮制后的饮片有酒香气，同时本项炮制工艺用时短，展示出本项炮制工艺效率。

在制洋金花的单因素考察中选取东莨菪碱含量为指标，但在炮制过程中发现虽然水分在上海市中药饮片炮制规范[6]中没有明确规定，但其会影响贮藏时间、外观等方面，在正交试验中以水分为评价指标，以2015版《中国药典》对洋金花水分[1]规定的不超过11%为上限，下限不低于5%，制洋金花炒制后表面太干燥，水分含量太少，外观变形难识别，造成其性状鉴别难度。

洋金花作为一种毒性药材，临床上多有不良反应报道，本项研究对制洋金花进行炮制工艺研究，运用正交试验对制洋金花的炮制工艺研究，为其他研究工作者提供制洋金花的炮制工艺参考，提高制洋金花的内在质量稳定性，同时在建立药材内在质量稳定性的情况下，才有药材功效和毒性的稳定性。优化制洋金花的炮制工艺有利于其质量控制和临床用药安全，下一步将开展制洋金花的毒性试验研究，同时查找出制洋金花中的毒性标记物成分。