滇老鹳草药材鉴别方法改进

黄云先 赵健胜 曹云芸

丽江市食品药品检验所，云南 丽江 674100

滇老鹳草来源于牻牛儿苗科植物滇老鹳草GeraniumnepalenseSweet干燥地上部分。别名老鹳草、五叶草、老官草、六阳草、五瓣草、猫脚迹、老观草[1]、尼泊尔老鹳草[2]。老鹳草来源于牻牛儿苗科的两属植物，即牻牛儿苗属和老鹳草属的不同植物[4]。牻牛儿苗属植物我国约有四种，老鹳草属植物我国约有55种，云南省约产21种。《云南省中药饮片标准》2005年版第二册收载的滇老鹳草为尼泊尔老鹳草GeraniumnepalenseSweet。老鹳草属植物全草富含老鹳草鞣质，干叶含老鹳草鞣质、金丝桃苷，又含类没食子酸、琥珀酸、钙盐、甜菜碱[3]、黄酮类槲皮素、山奈酚[2]等，《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药中对滇老鹳草的鉴别对照药材薄层色谱鉴别，本实验参照文献[5]，通过对云南省丽江古城区和玉龙县5个批次的滇老鹳草样品做了显微鉴别及专属性较强的成分没食子酸的薄层色谱鉴别，以建立一个专属性更强的鉴别方法，从而达到控制滇老鹳草药材质量的目的。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器 德国塞多利斯BT224S电子分析天平；梅特勒MS205DU电子分析天平；Purelab Flex 超纯水机。

1.2 实验材料

1.2.1 试药试剂 没食子酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201906)；老鹳草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121557-201102)；三氯甲烷、甲酸乙酯 、甲酸、甲醇、、乙醇、乙酸乙酯环己烷、丙酮、正丁醇(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)；水(实验室自制UP水，Ω=18.3); 硅胶GF254薄层板(青岛海洋化工)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工)；硅胶G薄层板(美国莫克)。

1.2.2 样品来源 采集丽江市玉龙县、古城区不同五个地方的样品共5个：

D1. 2015年9月，采收于丽江市玉龙县白沙乡玉湖村，为野生品种；为干燥地上部分。标本为全株(大样)。

D2. 2015年6月，采收于丽江市古城区祥云街道办事处吉祥社区，为野生品种；为干燥地上部分。

D3. 2015年9月，采收于丽江市玉龙县黎明乡黎明村，为野生品种；为干燥地上部分。标本为全株(溯源小样)。

D4. 2015年7月，采收于丽江市玉龙县拉市乡，为野生品种；为干燥地上部分。

D5. 2015年5月，采收于古城区束河街道办开文社区九子海，为野生品种；为干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别(改进自拟方法) 本品茎横切面 表皮由2～3列薄壁细胞组成，皮层为数列细胞，内侧厚壁细胞环明显，维管束8～9个，外韧型，呈辐射状排列；形成层不明显，韧皮部宽广，木质部狭小，导管散列其中。薄壁细胞中草酸钙簇晶众多。

粉末显微特征：本品粉末灰绿色。草酸钙簇晶众多而小，直径10～20 μm。气孔多为不定式，副卫细胞4～5个。非腺毛1～4细胞，基部细胞稍宽，尖端较长；腺毛短小，头部圆形或椭圆形，腺柄1～4个细胞组成。螺纹导管多见；可见淀粉粒，多为单粒球形散在。见粉末显微图2A～F。

2.2 薄层鉴别(改进自拟方法) 取本品LO1到LO5号粉末(过四号筛)1 g，加水100 mL，加热煎煮30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取三次，每次20 mL，取乙酸乙酯液水浴(60 ℃)上蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取滇老鹳草对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取没食子酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》第四部附录试验，分别吸取上述两种溶液各5 μL和10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯 -甲酸(5∶5∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对品色谱相应的位置上，显相同蓝色的斑点。不同点样量的薄层图如图3所示。

3 分析方法验证

3.1 样品溶液制备试验筛选 方法1：分别取本品粉末0.3 g和0.5 g(过四号筛)，加甲醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法2：分别取本品粉末0.3 g和0.5 g(过四号筛)，加乙醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法3：取本品粉末0.5 g，加70%甲醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法4：取本品粉末0.5 g，加70%乙醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法5：取本品粉末0.5 g，加50%甲醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法6：取本品粉末0.5 g，加50%乙醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法7：取本品粉末0.5 g，加30%甲醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法8：取本品粉末0.5 g，加30%乙醇20 mL，处理步骤同方法1。

方法9：分别取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加热煎煮30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。作为供试品溶液。

方法10：分别取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加热回流30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。作为供试品溶液。

方法11：分别取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加热回流30 min，滤过，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。作为供试品溶液。

方法12：分别取本品粉末0.5 g和1 g，加水100 mL，加热煎煮30 min，滤过，滤液用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解。作为供试品溶液。

通过实验室实验，发现方法9操作可行性高，分离效果良好，方法验证效果良好，决定选用方法9中取1 g的方法为最终供试品制备方法。

3.2 展开剂筛选 展开剂1：乙酸乙酯-甲醇 -水(8∶5∶0.2)；

展开剂2：乙酸乙酯-甲醇 -水(8∶5∶2)的下层溶液；

展开剂3：三氯甲烷-甲醇-水(8∶5∶0.2)；

展开剂4：环己烷-乙酸乙酯-甲醇(6∶2.5∶1)；

展开剂5：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)；

展开剂6：三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.8)；

展开剂7：甲苯(水饱和)-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)；

展开剂8：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)；

展开剂9：正己烷-甲醇(1∶ 9) ；

展开剂10：正己烷-乙酸乙酯(1∶4)。

饱和10 min，上行展开。

通过比对用展开剂6号展开时RF值为0.37，在0.2～0.8药典规定的范围，展开效果好。

3.3 检视方法的选择 喷以10%磷钼酸显色；喷以2%三氯化铁50%的乙醇溶液；喷以5%氯化铁乙醇液；紫外光灯(365 nm)下检视；喷以5%三氯化铁乙醇液，再在紫外光灯(365 nm)下检视。选用上述5种方法检视，第三种斑点清晰且方法简便。

3.4 点样方式及点样量考察 点样方式为接触点样；点样量为2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。温度及相对湿度的影响 按照试验所得薄层色谱条件，考察本品在温度5～30 ℃、相对湿度10%～75%展开时，对薄层色谱结果的影响。结果表明，在上述温度、湿度范围内对该薄层色谱结果无明显影响，点样量为10 μL斑点效果好。

3.5 预平衡试验 按照试验所得薄层色谱条件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展开，对薄层色谱结果的影响。结果表明，未平衡的展开边缘效应较明显，平衡15 min与平衡30 min展开，所得分离度均较好，且无明显差异。因此采用预平衡15 min展开。

3.6 重复性 不同产地的5批次样品的检测结果表明，该方法具有重复性。

4 讨论

4.1 显微鉴别方法建立 显微鉴定作为鉴别中药、中成药的手段之一，其方法可变性不强、操作简便、而特异性较强，可以说利用显微特征对比鉴定对大多数中药材都行之有效。经实验，滇老鹳草也不例外，的确具有其显著的特异性。

4.2 引进代表性对照品 民族药标准现阶段整体质量标准水平较低，仍多集中于药材基源及性状鉴定的研究，尚未建立指标性成分的质量控制，原标准未引进代表性对照品进行定性。通过大量查找资料，考虑滇老鹳草的传统主要功效为止泻止血，根据文献报道，老鹳草属植物主要含鞣质类没食子酸、黄酮类槲皮素、山奈酚等，故考虑引进没食子酸作为其代表性成分研究制定薄层色谱鉴别方法。

4.3 薄层鉴别方法建立 依据没食子酸易溶于水、醇和醚；具有酚(易被氧化和三氯化铁水溶液生成蓝黑色沉淀)及羧酸(加热时失去二氧化碳成焦性没食子酸)的性质。试验考察了采用不同取样量，选用水及不同比例的甲醇和乙醇采用超声、加热煎煮及回流提取方法，跟着考察了水提的提取液再用不同的有机溶剂乙酸乙酯、正丁醇及水饱和正丁醇提取的多种方法做对比，最终实验验证采用方法9提取效果较好，能有效的提出没食子酸。

展开剂的选择在使用不引入甲酸的展开剂如1～4号及9号10号展开时，有的在原点形成堆积或展开不上去，用7号及8号展开剂展开，结果斑点不太清晰，5号和6号展开剂的选择参考了《中国药典》2015版中五倍子中鞣质类成分没食子酸薄层鉴别方法中的三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1，V/V/V)。实验考察了展开剂中甲酸比例对展开效果的影响，结果是6号展开剂三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶0.8，V/V/V)展开能使没食子酸处于游离状态，斑点分离效果好，Rf值适中，且无拖尾现象。

最终采用方法9制备供试品溶液，硅胶G薄层板，点样量10 μL，以展开剂6号15 mL为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇液，所得薄层色谱斑点清晰，分离较好，易判断结果，且重现性好。

5 结论

此次实验新拟的显微鉴别方法操作简便、特异性强，建议标准修订时增加显微鉴别。薄层色谱条件可行有效，原标准中鉴别项下未引进代表性对照品进行定性，考虑引进没食子酸作为其代表性成分，建议标准修订时增加现拟方法，应与没食子酸对照品及滇老鹳草对照药材色谱相同。可见以没食子酸作为滇老鹳草药材标识性成分有其合理性。可用于滇老鹳草药材的质量控制，以提高民族药材的质量标准，也可用于制定滇老鹳草对照药材标准研制的起草。