芒果细菌性角斑病菌内切葡聚糖酶基因的克隆与表达分析

姚全胜 杨倩 柳凤 詹儒林

摘  要：由柑橘黃单胞菌芒果致病变种（Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae， Xcm）引起的芒果细菌性角斑病是芒果上的一种重要的细菌性病害。利用同源基因克隆技术克隆了Xcm上内切葡聚糖酶（endoglucanase）基因CEL的全长，经测序后运用多种生物信息学软件对其序列进行分析。结果表明：CEL基因的完整阅读框包含1134 bp，编码377个氨基酸;预测分子量为40.72 kDa;等电点为9.01;不稳定指数39.93，为稳定蛋白;亲水性为–0.081，有信号肽;总磷酸化位点有51个，无跨膜螺旋;在二级结构预测中，α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸结构分别为35.28%、6.10%、16.45%和42.18%。经保守结构域预测，具有Cellulase保守结构域。系统进化树结果显示，该基因的氨基酸序列与X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的亲缘关系最近。以gyrB、GAPHD和rpoD作为内参基因，经qRT-PCR分析CEL在Xcm侵染芒果叶片12 h后表达量持续上升，明显高于对照，在72 h处为最大表达量，由此推断该基因在病菌侵染时发挥重要作用。

关键词：芒果;细菌性角斑病;内切葡聚糖酶;克隆;序列分析

中图分类号：S435      文献标识码：A

Cloning and Expression Analysis of Endo-1，4-β-D-glucanase Gene of Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae

YAO Quansheng， YANG Qian， LIU Feng*， ZHAN Rulin

South Subropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory for Post-harvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products of Hainan Province， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： Mango bacterial black spot which is caused by Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae is one of the most important bacterial diseases in mango. In this study， the CEL gene from Xcm was cloned using the homologous cloning method， the biochemical feature， tertiary structure and phosphorylation sites of the CEL protein were predicted by a variety of bioinformatics softwares. The results showed that the total length of cDNA was 1134 bp， encoding 377 amino acid polypeptides. The molecular weight of the protein was 40.72 kDa， the theoretical isoelectric point was 9.01， the instability index was 39.93， which was a stable protein， the hydrophilicity was –0.081， and there was a signal peptide in the endoglucanase. The total phosphorylation sites were 51， with no transmembrane helix. In the secondary structure prediction， the α - helix， β - corner， irregular curl and extended structure was 35.28%， 6.10%， 16.45% and 42.18%， respectively. According to the prediction of conservative domain， it had cellular conservative domains. Phylogenetic analysis showed that CEL gene had the closest genetic relationship with X. citri pv. punicae str. LMG 859 （CCF67690.1）. Using gyrB， GAPHD and rpoD as internal reference genes， quantitative real-time PCR analysis revealed that CEL expression was increasingly higher with the Xcm infecting mango leaves after 12 hours. The maximum expression was at 72 hours， which suggested that the gene played an important role in the infection of Xcm.

Keywords： mango; Xanthomonas citri pv. mangiferaeindicae; endoglucanase; cloning; sequence analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.022

植物細胞壁是植物体抵御各种逆境（生物胁迫和非生物胁迫）和正常生存的第一道防线，同时也是生物因子侵染植物体与植物相互斗争的重要场所。细胞壁降解酶作为病原菌重要的致病因子，其主要功能是降解植物细胞壁，降解的物质既可为病原菌提供营养物质，使其顺利在植物体内定殖、繁殖和扩散，又能破坏植物的细胞壁导致寄主植物细胞分离和组织溃烂死亡[1-3]。芒果细菌性角斑病是由柑橘黄单胞菌芒果致病变种引起的一种细菌性病害，危害芒果的叶片、枝条、花芽、花和果实。发病初期在病斑位置形成水渍状小点，进而扩大变成黑褐色多角型裂口，病斑的表面稍隆起，周围常有黄色的晕圈。从病害的症状可看出，病菌在侵染的过程中细胞壁降解酶起重要作用。本实验室前期采用3，5-二硝基水杨酸法测定了病原菌在侵染芒果的过程中细胞壁降解酶活性变化，产生6种主要细胞壁降解酶，其中β-1，4-内切葡聚糖酶活性较高，多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基半乳糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶次之，果胶甲基转移消除酶和多聚半乳糖醛酸转移消除酶较低，由此推测细胞壁降解酶是病原菌的一个重要致病因子[4]。为进一步了解病原菌产生的内切葡聚糖酶在病原菌侵染过程中的作用，本研究通过同源基因克隆技术，克隆病菌编码的β-1，4-内切葡聚糖酶的CEL基因，分析CEL基因的序列特征，并将获得的氨基酸序列与已获得的其他黄单胞菌的CEL蛋白序列相比较，构建系统发育进化树，分析CEL基因的亲缘性。通过qRT-PCR方法，对CEL基因在侵染芒果叶片时的表达情况进行分析，以期从细胞壁降解酶的水平探索病原菌的致病机理。

1  材料与方法

1.1  材料

供试菌株：供试病原菌编号为Xcm003，由本实验室分离自典型芒果细菌性角斑病症状的芒果果实，具有强致病力，经形态学观察、生理生化测定及全基因组序列分析鉴定为柑橘黄单胞菌芒果致病变种Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae[5]。供试引物：根据NCBI上公布的CEL基因序列，使用Primer Premier 5软件设计特异性引物，序列如下：CEL1：5-ATGTCCGCTGTCTGTTTTTC-3，CEL2：5-TCAGCGTGTCGTGCGTGCAA-3，引物序列委托天一辉远生物有限公司进行合成。

1.2  方法

1.2.1  CEL基因的扩增和克隆  使用天根细菌基因组DNA试剂盒提取Xcm003菌株DNA，以DNA为模板，PCR扩增反应体系：Taq-Plus PCR Forest Mix（2×） 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1 μL，DMSO 1.0 μL，补充ddH2O至总体积为25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循环40次;72 ℃延伸10 min;16 ℃保存。用1.5%的凝胶进行电泳检测，将目的条带进行切胶回收，连接pEASY-T1 Cloning Vector上并热击转化至Trans1-T1感受态细胞中，用载体上的通用引物M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer鉴定阳性克隆，将阳性克隆菌株送至天一辉远生物有限公司进行测序。

1.2.2  CEL基因的生物信息学分析  将拼接和去除载体序列后的CEL基因序列用DNAMAN软件进行氨基酸推导，将推导的氨基酸序列在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用Protein BLAST进行同源序列比对和保守结构域分析。利用在线Expasy数据库（http：//www.expasy.org/）、NetPhos3.1（http：//www.mybiosoftware.com/）和SignalP 4.1（http：//www.cns.dtu.dk/services/SignalP/）软件预测蛋白质的基本性质。利用在线SOPMA（https：/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）、Phyre2（http：//www. sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）和PyMOL（https：//pymol. org/2/）对蛋白质二级和三级结构进行预测。选取与Xcm003同源性高的其他菌株的蛋白，用MEGA 6.0软件采用邻接法构建进化树，采用5000次重复抽样评估。

1.2.3  CEL基因的表达分析  以gyrB、GAPHD和rpoD同时作为内参基因，以cDNA基因全长设计RT-PCR引物，F：CTGTGTCAGCAGCACCAT TG和R：CCAGCCACACATCTGCATTG。将健康无病芒果嫩叶，清洗干净后采用刺伤接种法在叶片背面接种病原菌，每个伤口吸取50 μL的菌液，覆盖伤口表面;于28 ℃，100%湿度保存。接种3、6、12、24、48、72 h后，吸取叶片表面的菌液，清洗干净后迅速冷冻，以未接种到芒果叶片的菌液为对照。采用TransZolTM UP Plus RNA Kit试剂盒提取RNA。利用TIANScriptⅡRT Kit反转录试剂盒进行反转录实验。结合Ct值采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，利用Excel软件制图。

2  结果与分析

2.1  CEL基因的扩增

以Xcm003菌株基因组DNA为模板，用特异引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，约在1100 bp处有一条明亮的扩增条带，经测序实际长度为1134 bp，与预期的目的条带大小相符，该序列已提交至GenBank，登錄号为MK386677。

2.2  CEL基因的生物信息学分析

用DNAMAN软件分析CEL基因序列，结果表明：CEL基因编码的双链核苷酸分子量为699.25 kDa，（G+C）摩尔分数为62.5%，（A+T）摩尔分数为37.4%，其中C的摩尔分数为34%。通过Protein BLAST比对分析，发现该基因含有一个Cellulase保守结构域和一个GH1超家族，与X. citri pv. mangiferaeindicae LMG 941菌株的endo-beta-1，4-glucanase B（CCG35265.1）基因的相似度为98%（图1）。对CEL基因推导出的氨基酸序列分析，发现CEL基因编码377个氨基酸，理论分子量为40 720.94;理论等电点为9.01，负电荷残基总数（Asp+Glu）有25个，正电荷残基总数（Arg+Lys）有30个，分子式：C1818H2793N503 O540S12，原子总数为5666;不稳定系数是39.93，为稳定性蛋白;脂肪系数为79.20，总平均亲水性为–0.081;在第20位氨基酸处有最大疏水性位点，为2.722;在第333位氨基酸处有最小疏水性位点，为–2.722。

利用在线软件预测CEL基因编码蛋白序列中无跨膜结构域，1～29位氨基酸为信号肽序列（图2），为膜外蛋白。该蛋白共有51个磷酸位点，其中苏氨酸（threonine）18个，酪氨酸（tyrosine）8个，丝氨酸（serine）25个。

该蛋白由α-螺旋（133AA，35.28%）、β-折叠（23AA，6.10%）、无规则卷曲（159AA，42.18%）和延伸结构组成（图3），该结构是基于PDB数据库中的c5hosA为模板，覆盖率为83%，可信度为100%（Chain： A： PDB Molecule： cellulase;PDB Title：crystal structure of the endo-beta-1， 4-glucanase xac0029 from 2 X. axonopodis pv. citri，相似度为71%）。

2.3  CEL蛋白的系统进化分析

将CEL基因序列推导为氨基酸序列后经protein Blast比对，挑取相似度高的不同菌株构建系统发育树（图4）。系统发育树表明，CEL蛋白与X. citri pv. mangiferaeindicae LMG 941（CCG35265.1）聚为一支，与Pseudomonas cissicol（OOW75189.1）、X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的进化水平接近，而与X. cannabis pv. phaseoli（KGK56529.1）和Xanthomonas sp. CFBP 7698（RJS02557.1）的较远。

2.4  CEL基因的表达分析

CEL基因在病菌正常生长条件下（对照），表达处于相对稳定状态，以rpoD、GAPHD和gyrB为内参基因，0～72 h的相对表达量介于2.14～2.38之间，且无显著差异（图5）。在病原菌侵染芒果叶片过程中，虽然内参基因rpoD、GAPHD和gyrB的表达量不同，但表达趋势相同，叶片表面菌液的CEL基因相对表达量在0～12 h与对照相似，随后表达量持续上升，72 h表达量最高。

3  讨论

β-1，4-内切葡聚糖酶作为纤维素酶系之一，其主要作用在纤维素分子内部非结晶区，通过水解β-1，4-糖苷键将长链的纤维素大分子截短，再与外切葡聚糖酶（又名纤维二糖水解酶，CBH）和β-葡聚糖苷酶（又名纤维二糖酶，BGL）协同作用将纤维素降解为葡萄糖，该降解途径已在纺织、洗涤和造纸等领域中广泛应用[6-8]。目前关于β-1，4-内切葡聚糖酶的研究主要集中在2个方面，一是作用于植物细胞壁的一种纤维素水解酶，是降解天然纤维素的重要成员，用于资源再利用方面[9-10];二是作为植物病原菌的一种重要致病因子，通过降解寄主的细胞壁，破坏植物的形态、细胞功能，使病原菌能在寄主体内繁殖和扩散，从而完成侵染过程[11-14]。高树广等[15]采用分光光度法，测定了离体条件下芝麻茎点枯病菌分泌的纤维素降解酶活性及变化趋势，结果均能检测到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，表明这组纤维素酶系能降解芝麻秸秆纤维素，是其病菌的重要致病因子。肖罗等[16]采用RT-PCR和RACE方法从香蕉穿孔线虫中获得编码β-1，4-内切葡聚糖酶基因的cDNA序列，该cDNA序列全长1630 bp，包含1个1404 bp的开放阅读框，编码467个氨基酸，理论分子量与等电点分别为48.22 kDa和6.04。序列分析结果表明，该酶含有糖基水解酶家族5的保守结构域，N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽，C端含有细菌式样的纤维素结合域。本研究利用同源基因克隆技术克隆了芒果细菌性角斑病病原菌CEL基因的全长，经测序分析发现，CEL基因的完整阅读框包含1134 bp，编码377个氨基酸;分子量为40.72 kDa，等电点为9.01，属于稳定蛋白，具有Cellulase保守结构域。系统进化树结果显示，该基因的氨基酸序列与X. citri pv. punicae str. LMG 859（CCF67690.1）的亲缘关系最近。qRT-PCR实验结果表明，病菌在侵染芒果叶片时，CEL基因随着接种时间的延长表达量持续增高，72 h表达量最高。从本研究结果还可看出，在接种病菌12 h内，CEL基因的相对表达量与对照差别不大，推测病菌在侵染芒果叶片时，不同细胞壁降解酶在不同的时间发挥各自作用，CEL基因编码的β-1，4-内切葡聚糖酶主要作用时间是在病菌与寄主接触偏后期。因本研究离体叶片72 h后发生萎蔫，RNA提取受阻，没有进一步监测到CEL基因表达量的变化情况，因而CEL基因后续表达量的变化需要在芒果活体中检测，但活体芒果受环境等多种因子的影响，结果不稳定，因此摸清CEL基因表达的具体时效还需进一步探讨。本研究获得了芒果细菌性角斑病β-1，4-内切葡聚糖酶基因，并研究该基因的表达情况，有助于了解病原菌致病基因的表达，后续研究将结合RNAi以及构建表达dsRNA的转基因植物，深入研究和验证该基因的功能，从而为防治芒果细菌性角斑病提供新的策略。

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责任编辑：黄东杰