苏黄止咳胶囊改善哮喘豚鼠气道重塑的作用及其机制

郭 超童希洋＃秦伟伟梁荣耀巫兴东王 真相 婷谭宁华*

（1.中国药科大学中药学院中药制药系，江苏 南京211198； 2.扬子江药业集团北京海燕药业有限公司，北京102206）

哮喘是一类由气道慢性炎症引发的常见呼吸道疾病，其发病受到遗传因素及环境因素的双重作用［1］，始动环节是炎症引起气道上皮细胞损伤，IL⁃4、IL⁃5 等炎症因子在病情发生发展过程中起到非常重要的作用［2］。气道重塑是呼吸道中炎性细胞对气道的浸润及损伤气道上皮细胞进而释放趋化因子、生长因子等导致气道的代偿性修复［3］，其长期持续时会超过机体的代偿能力，将引发气道结构的病理改变，重要特征之一是支气管平滑肌异常增殖所导致的增生［4］。JAK／STAT 信号通路广泛存在于细胞内，对机体发育、细胞分化、细胞稳态至关重要，也与多种细胞功能及生理病理过程密切相关，它可调控细胞周期相关蛋白表达，进而抑制支气管平滑肌细胞增殖，最终缓解气道重塑［5⁃6］，故阐明其参与哮喘相关疾病的研究具有重要意义。

苏黄止咳胶囊是由国医大师晁恩祥教授根据多年临床实践总结的经验方，并于2008 年2 月由国家食品药品监督管理局批准上市，是目前临床上唯一治疗感冒后咳嗽和咳嗽变异型哮喘的中成药［7］，该制剂由蜜炙麻黄、紫苏叶、地龙、蝉蜕、炒牛蒡子、五味子、前胡、蜜炙枇杷叶、炒紫苏子9 味中药按一定比例及工艺加工制成，具有止咳、抗炎、平喘、祛痰、免疫调节的功效［8］，课题组前期对其挥发性成分、非挥发性成分、HPLC 指纹图谱进行了研究［9⁃11］。目前，关于苏黄止咳胶囊的文献报道大多集中在其临床疗效及药理活性［12⁃13］；课题组前期发现，该制剂可通过抑制内质网应激介导NLRP3 炎症小体活化来减轻气道炎症，进而达到改善咳嗽变异型哮喘的症状［14］，其祛痰机制是促进结肠内肝细胞生长因子（HGF）产生，进而经血液循环转移至肺部，并通过EGFR⁃MUC5AC 信号通路来改善肺部炎症，从而促进痰液排出［15］；本实验旨在从调节JAK／STAT 信号通路探讨它缓解哮喘气道重塑的作用机制，以期为阐明其平喘机制及临床使用提供依据。

1 材料

1.1 动物 雄性健康普通级豚鼠36 只，体质量180～220 g，购自江苏省南京市青龙山动物饲养中心，动物生产许可证号SCXK（苏）2017⁃0011，在清洁级动物房饲养，每天光照12 h，保持温度（25±1）℃、相对湿度40%～70%，实验前适应性喂养1 周。

1.2 细胞株 大鼠支气管平滑肌细胞（RBSMCs），购自上海拜力生物科技有限公司。

1.3 试剂与药物 苏黄止咳胶囊（国药准字YBZ00172008），购自扬子江药业集团北京海燕有限公司；硫酸沙丁胺醇片（批号E170403），购自江苏亚邦爱普森药业有限公司。卵清蛋白（OVA，批号90065913），购自美国Sigma 公司；Al（OH）3（批号20161031），购自天津市致远化学试剂有限公司；MTT（批号ST315），购自上海碧云天生物技术有限公司；豚鼠白介素⁃4（IL⁃4）、豚鼠白介素⁃5（IL⁃5）、豚鼠组胺酶联免疫（ELISA）试剂盒，购自美国Kejian 公 司；氨茶碱（批号G170103），购自南通飞宇生物科技有限公司；RPMI 1640 培养基及胎牛血清，购自以色列BI 公司；兔 抗Cyclin D1、CDK4、E2F、Rb1、ERK、Phospho⁃ERK、p27、STAT3、PCNA、Akt 抗体，购自美国Proteintech 公司；兔抗p21 抗体，购自美国EPIT Mics 公司；兔抗Cyclin A、Phospho⁃Rb、Phospho⁃STAT3、Phospho⁃JAK2、JAK2 抗体，购自美国Affbiotech公司；兔抗 Phospho⁃Akt抗体、GAPDH 抗体、兔二抗，购自美国CST 公司。

1.4 仪器 DMi8 型倒置显微镜、DMi1 型荧光显微镜（德国Leica 公司）；M491 型酶标仪（美国BioTek 公司）；Tanon 2600 型凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；稳压稳流电泳仪（美国Bio⁃Rad公司）；电子分析天平［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；超纯水系统（美国Millipore 公司）；细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药

2.1.1 分组 36 只豚鼠随机分为正常组，模型组，苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组，阳性对照组（沙丁胺醇，抑制肥大细胞等致敏细胞释放过敏介质而达到平喘目的），每组6 只。

2.1.2 造模 除正常组外，其余各组豚鼠均腹腔注射1 mg／mL OVA 和10 mg／mL Al（OH）3混悬液1 mL，正常组豚鼠腹腔注射等量生理盐水，1 周后相同方法处理各组豚鼠进行加强致敏，并于每天给药1 h 后进行雾化刺激。具体方法为将豚鼠置于大玻璃烧杯中，杯口用保鲜膜罩住，留有一口与超声雾化器连接，将1%OVA 溶液倒入雾化器槽内，打开开关进行雾化刺激，时间90 s，每隔1 d 进行1 次，共7 次。

2.1.3 给药 第3 周对豚鼠进行灌胃给药，每天于同一时间进行1 次，连续2 周，其中苏黄止咳胶囊（每粒相当于4.5 g 生药）用生理盐水制成适宜质量浓度的溶液。各组给药剂量及体积分别为苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组1.5、3、6 g／kg，阳性对照组5 mg／kg，正常组、模型组豚鼠灌胃给予等体积生理盐水。

2.2 咳喘潜伏期测定 于末次给药1 h 后，用1%OVA 雾化刺激引喘豚鼠，记录各组咳喘潜伏期。

2.3 气管病理变化观察 处死豚鼠，立即分离出气管，10%福尔马林固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，HE 染色，在光学显微镜下观察其平滑肌增生情况，通过Image pro⁃plus 软件对图像进行分析，分别选取2 个最大直径的气管壁进行测定，其气管平滑肌厚度分别设为T1、T2，取2 个气管面管腔内周长（PI）进行标准化处理，以［（T1＋T2）／PI］ ×100%表示。

2.4 肺组织病理变化观察 处死豚鼠，立即分离出肺组织，10%福尔马林固定，石蜡包埋，切出厚度为4 μm 的组织切片，HE 染色，在光学显微镜下观察肺组织病理变化，并对图像结果进行分析。

2.5 肺组织IL⁃4、IL⁃5、组胺水平检测 取豚鼠肺组织适量，加入预冷含PMSF 的PBS 缓冲液充分匀浆，离心后取上清，采用BCA 法测定总蛋白表达，按ELISA 试剂盒说明书检测IL⁃4、IL⁃5、组胺水平与相应总蛋白表达的比值，即为三者相对值。

2.6 肺组织ERK 蛋白表达检测 采用Western blot 法。取豚鼠肺组织适量，加入预冷含PMSF 的RIPA 裂解液充分匀浆，离心后取上清，采用BCA法测定蛋白表达，样品经SDS⁃PAGE 电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影等过程后得到目的蛋白条带，通 过Image pro⁃plus软件处理条带，得到p⁃ERK、ERK 灰度值，两者比值即为ERK 相对值。

2.7 豚鼠离体气管舒张率测定 处死健康豚鼠，剥离出颈部气管，制成适宜长度的螺旋条，转移至恒温灌流槽内，槽中有K⁃H 液，预先通入95% O2和CO2混合气体，调节恒温装置维持灌流槽内温度37 ℃，予以1.5 g 起始张力，待其平衡稳定后，将灌流装置与BL⁃420 生物机能实验采集系统相连接，记录一段正常活动曲线，每15 min 换液1 次，共3 次，加入10 mL K＋溶液，孵育10 min 以引发收缩，10 mL K⁃H 液洗去K＋溶液，每15 min 1 次，共3 次，末次换液时灌流槽中加入10 mL K⁃H 液，随即滴加100 μL 组胺工作液使其终浓度为0.3 mmol／L，观察张力曲线，待气管收缩张力达峰值时并稳定5 min 后，分别加入125、250、500 μg／mL苏黄止咳胶囊及50 μg／mL 阳性药氨茶碱（抑制Ca2＋变化达到松弛平滑肌，改善平滑肌细胞增殖），以给予组胺后的张力曲线为阴性对照组，记录灌流槽中气管条张力，计算舒张率，公式为舒张率＝［（加入组胺后张力－加入药物后张力）／加入组胺后张力］ ×100%。

2.8 细胞增殖检测 采用MTT 法。用含10%胎牛血清的RPMI⁃1640 培养基培养RBSMCs，取3～6代细胞用于实验，以0.3 mmol／L 组胺诱导后加药处理48 h，其中苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组剂量分别为125、250、500 μg／mL，氨茶碱组剂量为50 μg／mL。在96 孔板中加入20 μL MTT（终张力质量浓度0.5 mg／mL），37 ℃下孵育4 h，弃去液体，加入150 μL DMSO 至充分溶解为蓝紫色溶液，采用酶标仪在490 nm 波长处测定细胞各孔光密度（OD），重复3 次，取平均值，观察RBSMCs 增殖情况。

2.9 PCNA 荧光强度检测 采用免疫荧光法。RB⁃SMCs 细胞接种在24 孔板上，待细胞生长到适宜的浓度后用50 μmol／L 组胺和药物处理24 h，其中苏黄止咳胶囊低、中、高剂量组分别为125、250、500 μg／mL，氨茶碱组为50 μg／mL。取处理后的24 孔板，冷PBS 缓冲液浸洗24 孔板3 次，每次3 min，0.4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X⁃100 室温通透，BSA 溶液封闭，PCNA 一抗孵育4 ℃过夜，PBS 缓冲液浸洗3 次，每次5 min，吸掉孔板内缓冲液，在避光条件下滴加荧光二抗工作液，孵育30 min，PBS 缓冲液浸洗3 次，每次5 min，每孔加入80 μL DAPI 避光孵育10 min，在荧光显微镜下观察图像。

2.10 Ca2＋荧光强度检测 取处理后的细胞，往24孔板中加入150 μL Fluo⁃4／AM 工作液，在37 ℃细胞培养箱中孵育30 min，PBS 缓冲液洗涤细胞3次，在荧光显微镜下观察并拍摄图像，通过Image pro⁃plus 软件处理图片。

2.11 细胞中目的蛋白表达检测 采用Western blot 法。取处理后的细胞，加入预冷RIPA 裂解液和PMSF 制备蛋白样品，经SDS⁃PAGE 电泳、转膜、封闭、孵育抗体、显影等过程，通过Image⁃ProPlus 软件得到相应蛋白灰度值，计算磷酸化蛋白与其对应灰度值或内参GAPDH 灰度值的比值来反映上述目的蛋白相对表达。

2.12 统计学分析 通过GraphPad Prism 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠潜伏期的影响 如图1 所示，模型组豚鼠引喘潜伏期相较于正常组豚鼠降低（P＜0.01）；苏黄止咳胶囊各剂量相对于模型组，豚鼠咳喘潜伏期延长，并呈剂量依赖性（P＜0.05，P＜0.01）；阳性对照组也有明显作用（P＜0.01）。

图1 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠咳喘潜伏期的影响Fig.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on cough latency in OVA⁃induced guinea pigs

3.2 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠气管的病理变化的影响 如图2 所示，与正常组比较，模型组豚鼠气管平滑肌层结构模糊，出现增厚现象（P＜0.05）；相较于模型组，苏黄止咳胶囊中、高剂量组改善气管平滑肌层结构（P＜0.05，P＜0.01），阳性对照组亦然（P＜0.01）。

图2 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠气管病理变化的影响Fig.2 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the trachea pathological changes of OVA⁃induced guinea pigs

3.3 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织病理改变的影响 如图3 所示，与正常组比较，模型组豚鼠肺泡隔增厚，并伴有炎性细胞浸润，肺组织结构模糊，管腔内出现大量渗出物（P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊各剂量组、沙丁胺醇组均改善肺部病理情况（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织病理改变的影响Fig.3 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the lung tissue pathological changes of OVA⁃induced guinea pigs

3.4 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织中IL⁃4、IL⁃5 和组胺水平的影响 如图4 所示，模型组豚鼠IL⁃4、IL⁃5、组胺水平较正常组升高（P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及沙丁胺醇组抑制三者产生（P＜0.01）。

图4 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织中IL⁃4、IL⁃5、组胺水平的影响Fig.4 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the levels of IL⁃4，IL⁃5 and histamine in the lung tissue of OVA⁃induced guinea pigs

3.5 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织中ERK 蛋白表达的影响 如图5 所示，与正常组比较，模型组豚鼠肺组织中ERK 蛋白磷酸化增加（P＜0.05）；相较于模型组，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及沙丁胺醇组抑制ERK 蛋白磷酸化（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 苏黄止咳胶囊对OVA 诱导哮喘豚鼠肺组织中ERK 蛋白表达的影响Fig.5 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expression of ERK in the lung tissue of OVA⁃induced guinea pigs

3.6 苏黄止咳胶囊对组胺诱导豚鼠离体气管舒张率的影响 如表1 所示，苏黄止咳胶囊呈剂量依赖性地增加组胺诱导豚鼠离体气管的舒张率（P＜0.05，P＜0.01），氨茶碱组亦然（P＜0.01）。

表1 苏黄止咳胶囊对组胺诱导豚鼠离体气管舒张率的影响（， n＝6）Tab.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the re⁃laxation rate of histamine⁃induced isolated trachea in guinea pigs（， n＝6）

表1 苏黄止咳胶囊对组胺诱导豚鼠离体气管舒张率的影响（， n＝6）Tab.1 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the re⁃laxation rate of histamine⁃induced isolated trachea in guinea pigs（， n＝6）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.7 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 增殖的影响 如图6 所示，与正常组比较，模型组OD值升高（P＜0.01）；相对于模型组，苏黄止咳胶囊高剂量组、氨茶碱组OD值降低（P＜0.05）。

图6 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 增殖的影响Fig.6 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the cell proliferation of histamine⁃induced RBSMCs

3.8 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中PCNA蛋白表达的影响 如图7 所示，与正常组比较，模型组细胞中PCNA 蛋白荧光强度增加（P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及氨茶碱组PCNA 蛋白荧光强度降低（P＜0.01）。

图7 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中PCNA 蛋白表达的影响Fig.7 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expression of PCNA in histamine⁃induced RBSMCs

3.9 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中Ca2＋浓度的影响 如图8 所示，与正常组比较，模型组细胞中Ca2＋浓度升高（P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及氨茶碱组细胞中Ca2＋浓度降低（P＜0.01）。

图8 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中Ca2＋浓度的影响Fig.8 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on Ca2＋concentration in histamine⁃induced RBSMCs

3.10 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中JAK2、STAT3、Akt 蛋白表达的影响 如图9 所示，与正常组比较，模型组p⁃JAK2、p⁃STAT3、p⁃Akt 蛋白表达上调（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及氨茶碱组p⁃JAK2、p⁃STAT3、p⁃Akt 蛋白下调（P＜0.05，P＜0.01）。

图9 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中JAK2、STAT3、Akt 蛋白表达的影响Fig.9 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of JAK2，STAT3 and Akt in histamine⁃induced RBSMCs

3.11 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 细胞周期相关蛋白的影响 如图10 所示，与正常组比较，模型组Cyclin D1、CDK4、p⁃Rb、E2F 蛋白表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及氨茶碱组Cyclin D1、CDK4、p⁃Rb、E2F 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图10 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中Cyclin D1、CDK4、Rb、E2F 蛋白表达的影响Fig.10 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of Cyclin D1，CDK4，Rb and E2F in histamine⁃induced RBSMCs

3.12 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 细胞周期抑制蛋白p21、p27 表达的影响 如图11 所示，苏黄止咳胶囊剂量依赖性地增加p21、p27 蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01），氨茶碱组亦然（P＜0.01）。

图11 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中p21、p27 蛋白表达的影响Fig.11 Effects of Suhuang Antitussive Capsules on the protein expressions of p21 and p27 in histamine⁃induced RBSMCs

3.13 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中ERK蛋白表达的影响 如图12 所示，与正常组比较，模型组p⁃ERK 蛋白表达升高（P＜0.01）；相较于模型组，苏黄止咳胶囊中、高剂量组及氨茶碱组p⁃ERK 蛋白表达降低（P＜0.01）。

图12 苏黄止咳胶囊对组胺诱导RBSMCs 中ERK 蛋白表达的影响Fig.12 Effect of Suhuang Antitussive Capsules on the pro⁃tein expression of ERK in histamine⁃induced RBSMCs

4 讨论

气道重塑是慢性顽固性哮喘的病理基础［3］，通常会引起哮喘患者的气道结构发生病理性改变，引起哮喘反复发作及气道高反应，加重病情。哮喘早期阶段是由气道炎症引起的［16］，炎性细胞的浸润损伤气道上皮，刺激机体的代偿性修复［17］。本实验采用OVA 诱导豚鼠构建哮喘模型来研究苏黄止咳胶囊改善哮喘的体内药效与机制。

目前临床上治疗哮喘的主要药物是糖皮质激素，其通过缓解气道炎症，而针对改善气道重塑并没有特效的药物，本研究正是立足于此探讨中成药苏黄止咳胶囊改善气道重塑的作用及机制。气道重塑发生时的一个重要的气道生理结构病变是炎症诱导支气管平滑肌增生［18］。其中组胺在气道炎症、支气管平滑肌增生等一系列组织病理变化过程中起了重要作用，本研究通过组胺诱导豚鼠支气管收缩来考察苏黄止咳胶囊对离体状态下支气管平滑肌舒张率的影响，以及建立组胺刺激RBSMCs 细胞体外模型来探究苏黄止咳胶囊缓解气道重塑相关的哮喘作用机制。

细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal⁃regulated kinase，ERK）通路是一种重要的细胞内信号转导通路，它参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程［19］。哮喘的主要病理特征包括慢性气道炎症和气道重构等，研究表明ERK 信号通路与气道炎症和气道重构关系密切［20］。本实验发现，苏黄止咳胶囊干预后，豚鼠肺组织及RBSMCs 中的ERK 蛋白活化明显下降，表明苏黄止咳胶囊改善气道重塑与调节ERK 信号通路有关。

JAK／STAT 信号通路是众多细胞因子信号转导的重要途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及炎症等过程［21］。研究表明在调节支气管平滑肌细胞增殖过程中JAK／STAT 信号通路发挥了重要的作用［22］。JAK／STAT 信号通路可以通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27 的表达，影响细胞周期相关蛋白的表达，从而调节细胞分裂与增殖［23］。本实验发现，苏黄止咳胶囊能逆转JAK／STAT 信号通路上相关周期蛋白的表达，表明苏黄止咳胶囊能够调控JAK／STAT 信号通路，抑制RBSMCs 增殖，从而发挥改善气道重塑的作用。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，指从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程，DNA 合成和细胞分裂是细胞周期的2 个主要事件［24］。周期蛋白在细胞分裂及增殖的进程中起着非常重要的调控作用［25］，周期蛋白（Cyclins）和与之相对应的周期蛋白依赖性激酶（CDKs），两者通过共价结合形成复合物来发挥作用［26］。Nishi等发现Cyclin D1 与CDK4 形成的复合物可以有效的作用于细胞周期调控限制点G1／S，影响细胞周期G1 期进入S 期，从而影响细胞增殖过程［27］。本实验发现通过苏黄止咳胶囊干预后，RBSMCs 中CyclinD1、CDK4 的表达显著下降，表明苏黄止咳胶囊可以减缓细胞由细胞周期G1 期进入S 期这一进程，抑制细胞增殖。

综上所述，苏黄止咳胶囊通过调节JAK／STAT信号通路，影响支气管平滑肌细胞分裂周期，缓解支气管平滑肌的增生，改善气道重塑的发生过程，从而发挥较好的平喘作用。