HPLC 法同时测定复方川参胶囊中7 种成分

2021-06-15高俊卿程仙送王丽丽

中成药 2021年4期

高俊卿程仙送王丽丽

（1.陕西省人民医院神经内一科，陕西西安710068； 2.西安航天总医院儿科，陕西西安710100）

急性脑卒中是糖尿病最常见的脑血管病变，我国患者约25%～30%因其而死亡［1⁃2］，同时罹患急性脑血管病变的几率约为正常人群的4～5 倍，严重威胁其生命安全［3］。复方川参胶囊为陕西省人民医院院内制剂，用于治疗糖尿病合并脑卒中，临床疗效良好，该制剂的制备工艺主要为醇提、水提、生药粉入药，但未见对其活性成分进行研究的报道。因此，本实验建立HPLC 法同时测定复方川参胶囊中羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 的含量，以期对该制剂质量进行有效控制。

1 材料

1.1 仪器 Prominence⁃i LC⁃2030C 3D 高效液相色谱仪，配置自动进样器、LC／Labsoluion 色谱工作站（日本岛津公司）；ME235S 电子分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；KQ⁃5200DE 数控超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 对照品（纯度98.0%，宝鸡市晨光生物科技有限公司）。复方川参胶囊（批号190104、190105、190106，0.4 g／粒）由陕西省人民医院药剂科制备。甲醇、乙腈为色谱纯（美国Honeywell 公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水［由Millipore 纯水仪（美国Millipore 公司）制备］。

2 方法与结果

2.1 色谱条件参考文献［4］报道。Intersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（含1.0 g／L 磷酸）（B），梯度洗脱（0～10 min，95%～90% B；10～40 min，90%～80% B；40～65 min，80%～70% B；65～100 min，60%～30%B）；体积流量0.8 mL／min；柱温35 ℃；检测波长203 nm（细叶远志皂苷、人参皂苷Re、人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷 Rb2）、321 nm（阿魏酸、羟基红花黄色素A）；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备精密称取对照品羟基红花黄色素A 9.00 mg、细叶远志皂苷4.50 mg、阿魏酸5.00 mg、人参皂苷Re 3.20 mg，人参皂苷Rg1 4.28 mg、人参皂苷Rb1 3.54 mg、人参皂苷Rb2 3.28 mg，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备参考文献［5］报道。取本品20 粒，倾出内容物，研细，混匀，精密称取4 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 70% 甲醇，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液制备按处方比例分别制备缺川芎、缺红花、缺人参、缺远志的阴性样品，按“2.3”项下方法制备，即得。

2.5 线性关系考察精密量取对照品溶液0.01、0.05、0.20、0.04、0.80、1.0 mL，分别置于1 mL量瓶中，70% 甲醇定容至1 mL，编号Ⅰ～Ⅵ，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以该成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度良好，阴性无干扰，表明该方法专属性强。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7 精密度试验取“2.5”项下对照品溶液Ⅲ，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2峰面积 RSD 分别为 1.21%、0.97%、1.02%、0.88%、1.12%、1.13%、0.92%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验取“2.5”项下对照品溶液Ⅲ，于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 峰面积RSD 分别为1.26%、1.06%、1.22%、1.37%、1.11%、1.19%、0.88%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验精密称取本品（批号190104）4 g，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 含量RSD 分别为0.854 2%、1.269 2%、1.301 8%、1.278 6%、0.988 9%、1.191 9%、1.030 5%，表明该方法的重复性良好。

2.10 加样回收率试验称取本品（批号190104，羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 质量分数分别为3.753 6、2.262 5、0.524 4、0.512 2、0.252 4、0.562 2、0.202 3 mg／g）2 g，平行9 份，加入对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，羟基红花黄色素A、细叶远志皂苷、阿魏酸、人参皂苷Re，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 平均加样回收率分别为97.97%、98.40%、97.89%、97.56%、98.22%、97.08%、99.08%，RSD分别为1.22%、1.00%、0.69%、0.84%、1.03%、1.07%、0.94%。

2.11 样品含量测定取3 批本品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 讨论

复方川参胶囊由川芎、人参、红花、当归、地龙、远志、冰片7 味中药组成，方中川芎、当归含有阿魏酸［6］，对慢性脑缺血等有保护作用［7⁃8］；人参主要成分人参皂苷［9］具有保护神经细胞、胰岛细胞作用［10⁃13］；红花及其成分羟基红花黄色素A能有效治疗缺血性脑卒中［14⁃16］；冰片能预防局灶性脑缺血［17］；远志及其成分细叶远志皂苷有抗痴呆、抗衰老等作用［18⁃19］；地龙可改善神经功能受损程度［20］。糖尿病已被证实为脑卒中独立危险因素之一［21］，故本实验选择上述成分作为检测指标。

本实验对色谱条件进行了优化，依据各成分色谱峰的面积值与分离度（≥1.5），确定阿魏酸、羟基红花黄色素A 检测波长为321 nm，细叶远志皂苷、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 为203 nm；中药复方成分众多，溶解性也不同，等度洗脱难以充分处理，故采用梯度洗脱；比较了Intersil C18、Agilent SB⁃C18、Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），发现Intersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）较理想；比较了流动相乙腈⁃水（含0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0 g／L 醋酸）、乙腈⁃水（含0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0 g／L 磷酸）、甲醇⁃水、乙腈⁃水，发现乙腈⁃水（含1.0 g／L 磷酸）洗脱效果最强，并且其目标峰分离度与保留时间符合要求；比较了不同柱温、体积流量、记录时间，发现柱温超过或低于35 ℃时目标峰分离度小或不能分开，体积流量高于或低于0.8 mL／min时目标峰分离度差；记录时间在100 min 后无色谱峰出现。最终确定，柱温为35 ℃，体积流量为0.8 mL／min，记录时间为100 min。