HPLC 法同时测定复方活血胶囊中6 种成分

2021-06-15何泽源张妍妍林楠李金玲冯

中成药 2021年4期

何泽源张妍妍林楠李金玲冯旭*

（1.广西中医药大学研究生学院，广西南宁530200； 2.广西中医药大学药学院，广西南宁530200）

近30 年来，中风位居我国人民过早死亡疾病因素的第一位［1］。复方活血胶囊为广西南宁宏康仁济堂中医院的院内制剂，由赤芍、黄芪、怀牛膝、川芎、水蛭、僵蚕等15 味药材组成，具有活血化瘀、搜风通络等作用，主治因中风所致的半身不遂、口舌歪斜等症状，长期临床效果良好。方中赤芍功效镇痛散瘀、凉血清热［2］，所含的芍药苷具有补血、抗肿瘤、抗氧化等作用［3］；黄芪功效补气升阳、益卫固表，所含的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对血管具有一定保护作用［4⁃5］，也是《中国药典》规定的含量测定指标成分；川芎功效活血行气、祛风止痛，所含的阿魏酸及其衍生物具有抑制血小板聚集［6⁃7］、抗血栓形成［8］等作用；怀牛膝功效活血通经、利尿通淋［9］，所含的β⁃蜕皮甾酮是《中国药典》规定的含量测定指标成分。目前，在复方活血胶囊原标准中只有简单的性状鉴别，故本实验首次建立HPLC 法同时测定该制剂中绿原酸、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯甲酸、β⁃蜕皮甾酮的含量，以期为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；L600 型台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DHG⁃9203A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；SQP 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；UPC⁃11⁃10T 优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2 试药 10 批复方活血胶囊由广西南宁宏康仁济堂中医院提供（批号 20190902、20190903、20190906、20190907、20170908、20190911、20190912、20190913、20190915、20190916）。绿原酸（批号5077，纯度98.3%）、芍药苷（批号5859，纯度98.9%）、β⁃蜕皮甾酮（批号4938，纯度99.6%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号5240，纯度98.8%）、苯甲酸（批号5986，纯度99.7%）对照品均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；阿魏酸对照品（批号0773⁃9910）购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃甲醇（B）⁃0.2%磷酸（C），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长240 nm；进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取绿原酸、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯甲酸、β⁃蜕皮甾酮对照品适量，甲醇溶解定容，即得（各成分质量浓度分别为0.070 45、0.190 1、0.016 22、0.014 50、0.041 21、0.013 58 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液取胶囊20 粒，倾出内容物，研细，精密称取2 g 粉末，置于250 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 甲醇超声处理60 min，冷却，甲醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液25 mL，水浴挥干后甲醇定容至10 mL，0.2 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按制剂处方和工艺，分别制备缺赤芍、缺黄芪、缺怀牛膝、缺川芎的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性考察取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分在对照品相同保留时间处有相应色谱峰，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察按“2.2.1”项下方法制备对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得绿原酸、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯甲酸、β⁃蜕皮甾酮峰面积RSD 分别为1.2%、0.94%、1.1%、0.55%、0.67%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验取同一份供试品溶液（批号20190916），在“2.1”项色谱条件下于2、4、6、8、12、24 h 进样测定，测得绿原酸、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯甲酸、β⁃蜕皮甾酮峰面积RSD 分别为1.8%、0.87%、1.1%、0.69%、0.77%、0.97%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验精密称取6 份胶囊（批号20190916），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苯甲酸、β⁃蜕皮甾酮含量RSD 分别为1.4%、1.6%、1.7%、1.0%、0.9%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称取6 份胶囊（批号20190916），每份约1.0 g，精密加入各对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率（RSD）分别为绿原酸98.74%（2.1%）、芍药苷98.85%（1.4%）、阿魏酸100.03%（2.2%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷98.54%（1.7%）、苯甲酸99.34%（1.5%）、β⁃蜕皮甾酮99.24%（2.0%）。

2.3.7 样品含量测定取10 批胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分筛选在复方活血胶囊中，赤芍、黄芪、怀牛膝补益气血，为君药；川芎活血行气，通络祛瘀，与君药配伍后互相佐制，为臣药。制定制剂质量标准时，需要以主要药效成分为指标［10］，本实验结合药理作用［11⁃13］和2020 版《中国药典》黄芪、怀牛膝、赤芍、川芎含量测定要求，选择赤芍中芍药苷、苯甲酸，黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷，怀牛膝中β⁃蜕皮甾酮，川芎中绿原酸、阿魏酸作为指标，进行含量测定。

3.2 供试品溶液制备方法筛选

3.2.1 提取溶剂考察了甲醇、水、95% 乙醇，50%乙醇，发现甲醇提取时各成分含量最高，提取效果最好。

3.2.2 提取方法考察了超声、回流、冷浸，发现超声、回流提取时各成分含量较高，以前者效果更好。

3.2.3 提取时间考察了30、60、90、120 min，发现提取60、90、120 min 时各成分含量较高，综合考虑其他因素，选择60 min。

3.2.4 料液比考察了1 ∶10、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶50，发现1 ∶25 时各成分含量较高，其原因可能是随着溶剂用量升高，各成分溶出增加，但当其用量达到某阈值时，杂质会导致成分溶出量反而降低。

3.3 色谱条件筛选

3.3.1 色谱柱考察了依利特、Waters、Inerstil等不同厂家的色谱柱，发现Waters 公司产者分离效果最好，重复性最理想。

3.3.2 流动相由于各成分极性差异较大，等度洗脱难以达到分离要求，故采用梯度洗脱。考察乙腈、甲醇、0.2% 磷酸不同组合，发现乙腈⁃甲醇⁃0.2%磷酸体系分离度良好，干扰少［14］。

3.3.3 检测波长通过HPLC⁃DAD 进行全波长扫描，发现各成分最大吸收波长分别为绿原酸330 nm、芍药苷235 nm、阿魏酸325 nm、毛蕊异黄酮葡萄糖苷223 nm、苯甲酸235 nm、β⁃蜕皮甾酮251 nm，即绿原酸、阿魏酸与其他成分差别很大，转换波长法效果不理想，但两者在240 nm 波长处也具有较高吸收，考虑到杂质峰干扰及成分含量差异、峰形等，确定为240 nm。