复方当归补血颗粒成型工艺的优化及质量控制

马 肖要林青张瑞堂张红梅*

（1.西北民族大学，甘肃 兰州730000； 2.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州730000）

月经不调的临床症状主要表现为月经异常［1］，若不及时治疗则病情加重，直接导致妇女不孕［2］，西医对其治疗效果较差，而中医从整体出发，体现了显著独特的优势［3］。祖国医学认为，月经不调主要与气血两虚、湿热下注、阴虚血热有关，故应选用补血活血、舒畅气机的方药进行辨证施治［4］。

经典名方桃红四物汤虽具行血通淤之力，但乏补益元气之能，而在此基础上加减具有益气补血的当归补血汤时，对月经不调的临床疗效将会大幅度提升［5⁃6］。甘肃省第二人民医院吴华主任医师通过将当归补血汤与桃红四物汤加减而组成复方当归补血汤，在益气生血的基础上兼能行血通淤，临床应用多年，取得了良好的效果，为了更好地使用该方，需要将其开发成医疗机构制剂，同时为方便患者用药，将其剂型确定为颗粒剂。

本实验在前期研究的基础上，以颗粒性状、成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性为考察指标，对复方当归补血颗粒处方及辅料种类、用量进行考察，优化成型工艺，并进行质量控制研究，以期为该制剂相关开发利用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 型高效液相色谱仪；SY3200⁃T 型超声波清洗器（上海声源超声波仪器设备有限公司）；BT125D 型电子天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；S⁃430 型PH 计（成都世纪方舟科技有限公司）；WFH⁃201B型紫外反射透射仪（上海精科实业有限公司）；ATS⁃4 型自动点样仪（瑞士Camag 公司）。

1.2 试剂与药物 阿魏酸（批号 110768⁃201913）、芍药苷（批号110736⁃201938）对照品及当归（批号120945⁃201916）、白芍（批号120976⁃201909）对照药材均购于中国食品药品检定研究院。蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇均为药用辅料级（安徽山河药用辅料股份有限公司）；CMC⁃Na 为药用辅料级（天津市凯信化学工业有限公司）。水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 颗粒制备 按照前期优选得到的提取工艺［7］制备，并结合生产实际进行适当调整。称取处方药材适量，加25 倍量水浸泡0.5 h 后提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩得稠膏，干燥得浸膏粉。将辅料按一定比例与浸膏粉混合均匀，加适量0.65% CMC⁃Na 作为润湿剂制成软材，呈“握之成团，触之即散”后过12 目筛制粒，60 ℃下干燥3 h，1、5 号筛整粒，即得。

2.2 指标检测 以颗粒形状、成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性的综合评分为评价指标，计算公式为综合评分＝（15／最大成型率）×成型率＋（15／最大堆密度）×堆密度＋（最小休止角×15）／休止角＋（20／最大溶化性）×溶化性＋（最小吸湿率×35）／吸湿率。

2.2.1 成型率 参考文献［8］ 报道。取3 份颗粒，每份约5 g，收集能通过1 号筛但不能通过4号筛者，称定质量，计算成型率，公式为成型率＝（过筛后颗粒质量／过筛前颗粒质量）×100%。

2.2.2 堆密度 参考文献［9］ 报道。取3 份过筛后的颗粒，每份约5 g，称定质量M，放入干燥的量筒中轻轻振动，直至体积不再下降为止，读出其近刻度处的体积数（V），计算堆密度，公式为堆密度＝M／V。

2.2.3 休止角 参考文献［10］ 报道，采用固定漏斗法测定。将串联的3 只漏斗固定于铁架台上，漏斗口距水平坐标纸上方1 cm（H），将颗粒沿最上端漏斗中自上而下流到坐标纸上，当底部形成的圆锥体接触到最下边的漏斗口时停止，平行5 份，读取圆锥体直径（2R），计算休止角α，公式为tgα ＝H／R。

2.2.4 溶化率 参考文献［11］ 报道。称取颗粒3 份，每份约0.5 g，放入3 个干燥至恒重的离心管中，加入5 mL 沸水搅拌，3 000 r／min 离心15 min，弃去上清液，残渣恒重后精密称定质量，计算溶化率，公式为溶化率＝（溶化颗粒质量／颗粒质量）×100%。

2.2.5 吸湿性 精密称取过筛后颗粒3 份，每份约0.5 g，放入3 个干燥至恒重的称量瓶中，称定质量，置于相对湿度75%的干燥器中48 h，再次称定质量，计算吸湿率，公式为吸湿率＝［（吸湿后质量－吸湿前质量）／吸湿前质量］ ×100%。

2.3 稀释剂种类筛选 将糖粉、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇按一定比例与“2.2”项下浸膏粉进行混合，加适量0.65%CMC⁃Na 作为黏合剂制软材，呈“握之成团，触之即散”后过12 目筛制粒，在60 ℃下干燥3 h，1、5 号筛整粒，测定成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性，结果见表1～2。由此可知，糖粉所得颗粒成型率较低，并且不利于糖尿病患者用药；可溶性淀粉所得颗粒溶化性较好，但休止角偏低，流动性不佳，影响其质量稳定性；甘露醇所得颗粒性状好，结块少，但堆密度较小，表明其孔隙率较高；乳糖、糊精所得颗粒外观性状理想，综合评分较高，故选择两者作为稀释剂。

表1 稀释剂种类对颗粒性状的影响Tab.1 Effects of diluent type on the characters of granules

2.4 黏合剂种类筛选 本实验按1 ∶0.25 ∶0.25比例称取浸膏粉、糊精、乳糖各6 份，分别以95%乙醇、0.65%CMC⁃Na 制软材，过12 目筛制粒，在60 ℃下干燥3 h，1、5 号筛整粒，测定成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性，结果见表3。由此可知，以95% 乙醇为黏合剂时粗颗粒较多，成型率、堆密度、休止角得分较低，故选择0.65%CMC⁃Na 作为黏合剂。

表2 不同稀释剂综合评分（分）Tab.2 Comprehensive scores for different diluents（score）

表3 不同黏合剂综合评分（分，， n＝3）Tab.3 Comprehensive scores for different adhesives（score，， n＝3）

表3 不同黏合剂综合评分（分，， n＝3）Tab.3 Comprehensive scores for different adhesives（score，， n＝3）

2.5 中心复合设计⁃响应面法优化 在辅料种类筛选实验的基础上，本实验选择糊精（A）、乳糖（B）、0.65%CMC⁃Na（C）用量作为影响因素，成型率、堆密度、休止角、溶化性、吸湿性的综合评分（Y）作为评价指标，按“2.2”项下方法制备颗粒，通过Design⁃Expert 软件进行3 因素5 水平中心组合设计，因素水平见表4，结果见表5。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

表5 试验设计与结果（分）Tab.5 Design and results of tests（score）

通过Design⁃Expert 8.05b 软件对表6 数据进行多元二次回归拟合，得方程为Y＝71.86＋0.60A－2.86B－3.44C＋9.93AB－11.11AC＋5.47BC＋1.79A2－3.85B2＋7.46C2（r＝0.954 3，P＜0.01），响应面分析见图1。由此可知，最优成型工艺为浸膏粉、乳糖、糊精、0.65% CMC⁃Na 比例1 ∶0.35 ∶0.25 ∶0.1，综合评分96.94 分。

图1 各因素响应面图Fig.1 Response surface plots for various factors

2.6 验证试验 根据“2.5”项下优化工艺进行3批验证试验，测得平均综合评分为95.97 分，与预测值96.94 分接近，表明辅料配比重复性理想。

2.7 TLC 定性鉴别 参考文献［12］ 报道。

2.7.1 当归 按“2.5”项下优化工艺制备颗粒，研细，取粉末约5.0 g，精密称定，加入2% NaHCO3溶液50 mL，超声（250 W、40 kHz）处理60 min，抽滤，滤液加10%盐酸调节pH 至2～4，以铺有适量硅藻土的布氏漏斗进行抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取2～3 次，合并乙酸乙酯层，减压回收溶剂至干，残渣加1 mL 甲醇溶解，制得供试品溶液；精密称取阿魏酸对照品1 mg，加甲醇1 mL 溶解，制得1 mg／mL对照品溶液；取当归对照药材粉末约4.0 g，按供试品溶液制备方法制得对照药材溶液；原处方去除当归后的其余药味制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。定量毛细管吸取上述4 种溶液各约8 μL，以甲苯⁃二氯甲烷⁃乙酸乙酯⁃冰乙酸（5 ∶3 ∶2 ∶1）［6⁃8］为展开剂展开，晾干后在365 nm 波长紫外灯下检视，结果见图2。由此可知，在与对照品色谱相应位置上呈现相同颜色荧光斑点，阴性无干扰。

图2 当归TLC 色谱图Fig.2 TLC chromatogram of Angelicae sinensis Radix

2.7.2 白芍 按“2.5”项下优化工艺制备颗粒，研细，取粉末约7.0 g，精密称定，加入20 mL 甲醇，室温下振荡提取60 min，以铺有适量硅藻土的布氏漏斗进行抽滤，滤液减压浓缩至干，残渣加1 mL甲醇溶解，制得供试品溶液；精密称取1 mg芍药苷对照品，加1 mL 甲醇溶解，制得1 mg／mL对照品溶液；取白芍对照药材粉末约2.0 g，按供试品溶液制备方法制得对照药材溶液；原处方去除白芍后的其余药味制备阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。定量毛细管吸取上述4种溶液各约4 μL，以乙酸乙酯⁃甲酸⁃冰乙酸⁃水（14 ∶1 ∶1 ∶2）［9］为展开剂展开，晾干后以现配的5%香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂显色，结果见图3。由此可知，在与对照品色谱相应位置上呈现相同颜色荧光斑点，阴性无干扰。

图3 白芍TLC 色谱图Fig.3 TLC chromatogram of Paeoniae Radix Alba

2.8 HPLC⁃DAD 含量测定

2.8.1 色谱条件 Thermo ODS Hypersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（含0.1%磷酸）（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～10% B；5～15 min，10%～15% B；15～20 min，15%B；20～30 min，15%～25% B；30～50 min，25%～60%B）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长230 nm（芍药苷）、323 nm（阿魏酸）；进样量10 μL。

2.8.2 供试品溶液制备 取研细的颗粒粉末约1.0 g，精密称定，置于50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超声（50 kHz、25 ℃）处理45 min，放冷，甲醇定容至刻度，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.8.3 对照品溶液制备 分别精密称取阿魏酸、芍药苷对照品0.6、2.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，得质量浓度分别为0.06、0.2 mg／mL 的对照品溶液，保存于4 ℃冰箱中，各精密吸取2 mL，置于同一5 mL 量瓶中，即得。

2.8.4 阴性样品溶液制备 原方去除白芍，其余药味制成阴性样品，按“2.8.2”项下方法制备，即得。

2.8.5 专属性试验 取供试品、对照品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.8.1”项色谱条件下进样测定，结果见图4。由此可知，供试品、对照品溶液中芍药苷保留时间分别为12.621、12.663 min，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

根据氨基酸序列不同，可将壳聚糖酶分为5个糖苷水解酶家族，分别为:GH-5、GH-8、GH-46、GH-75和GH-80。在这些家族中，GH-75的成员主要来自真菌和放线菌，GH-46家族来自于Bacillus和Streptomyces的壳聚糖酶，其催化特性、酶反应机理和蛋白结构已被广泛研究。

图4 各成分HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents

2.8.6 线性关系考察 精密吸取阿魏酸对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，芍药苷对照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，定容至5 mL 量瓶中，在“2.8.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，平行3 次。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行回归，结果见表6，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表6 各成分线性关系Tab.6 Linear relationships of various constituents

2.8.7 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.8.1”项色谱条件下各进样测定3 次，测得阿魏酸、芍药苷峰面积RSD 分别为2.23%、1.56%，表明仪器精密度良好。

2.8.8 重复性试验 精密称取颗粒6 份，按“2.8.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.8.1”项色谱条件下进样测定，测得阿魏酸、芍药苷含量RSD 均为1.83%，表明该方法重复性良好。

2.8.9 稳定性试验 取同一份“2.8.2”项下供试品溶液，于0、3、6、12、24 h 在“2.8.1”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得阿魏酸、芍药苷峰面积RSD 分别为0.54%、1.43%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8.10 加样回收率试验 精密称取颗粒9 份，随机分为3 组，每组分别精密加入低、中、高质量浓度对照品溶液，按“2.8.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.8.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，阿魏酸、芍药苷平均加样回收率分别为100.06%、99.75%，RSD 分别为1.99%、1.59%。

2.9 样品含有量测定 取3 份颗粒，按“2.8.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.8.1”项色谱条件下进样测定，计算含量。结果，阿魏酸质量分数分别为0.618、0.621、0.612 mg／g，平均0.617 mg／g；芍药苷质量分数分别为8.596、8.396、8.841 mg／g，平均8.611 mg／g。

3 讨论

3.1 辅料选择 为了将复方当归补血颗粒开发成可溶性颗粒，本实验在处方设计时将糖粉、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘露醇作为稀释剂。基于患者依从性结合各稀释剂综合评分，最终选择乳糖⁃糊精［13⁃15］进行实验。

3.2 优化方法选择 中心复合设计法相比正交设计或均匀设计法采用的线性数学模型，其所用的复相关系数、实验精度均有较明显的提升，预测值更接近真实值［16］。因此，本实验将单因素试验与该方法相结合，可使设计更科学合理。

3.3 指标成分选择 复方当归补血汤方中药味较多，成分复杂，药理活性、谱⁃效关系、网络药理学研究表明，阿魏酸为当归、黄芪、川芎共有成分，补血作用最强［17］；芍药苷是白芍主要有效成分［18］，为治疗血瘀证的主要物质基础［19］；藁本内酯对子宫平滑肌细胞不同形式的收缩都有舒张作用，显示出该成分在治疗妇科疾病方面的应用［20］。预实验对黄芪、红花、桃仁等药味的主要有效成分进行了HPLC 分析，发现无法进行含量测定，制成颗粒后藁本内酯色谱峰也消失。最终，本实验选择药理活性显著、含量较高、可准确定性的阿魏酸、芍药苷作为指标成分。

3.4 定性鉴别方法选择 本实验选择乙醚、乙酸乙酯作为阿魏酸萃取溶剂，发现经后者萃取所得的图谱斑点清晰、分离度好。为减少杂质干扰和拖尾现象，再分别采用Al2O3、硅藻土对提取液进行纯化，发现前者对阿魏酸、芍药苷均有吸附作用，故采用铺有适量硅藻土的布氏漏斗进行抽滤作为纯化方法。