消瘤止痛凝胶制备工艺的优化

李 江孙韶阳王 飘陈凌云*李争艳*

（1.昆明市中医医院，云南 昆明650500； 2.云南中医药大学，云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明650500； 3.青岛天成中药饮片有限公司，山东 青岛266000）

消瘤止痛方由土茯苓、山慈菇、姜黄、蜈蚣、土鳖虫、北细辛、肉桂、冰片、海风藤、干姜、川乌、丁香、石楠藤13 味药材组成，功效化痰散结、活血止痛、解毒消瘤，主治肿瘤所致疼痛，该方原以膏剂入药，使用时易对衣物产生油污。方中挥发油与其疗效密切相关，如姜黄挥发油可抑制癌细胞［1］，其所含芳姜黄酮可诱导癌细胞凋零［2］；丁香挥发油具有抗炎、镇痛效果［3］，其所含丁香酚对癌相关成纤维细胞有抑制作用［4］；北细辛所含挥发油具有抗炎、镇痛作用［5⁃6］，但全方制备工艺并未提取上述成分。为了保障临床疗效，本实验采用正交试验优化消瘤止痛方挥发油提取工艺，同时将该方制为使用便捷、患者顺应较好的水溶性基质凝胶，从而促进其临床推广。

为使消瘤止痛凝胶制备工艺中各主、客观评价指标的权重尽可能合理，本实验采用AHP⁃CRITIC混合加权法对各指标进行赋权，相对于AHP、Delphi、CRITIC 等单一赋权方法更适用。再通过D⁃Optimal 设计优化该制剂制备工艺，以期为其进一步开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱系统（美国Agilent公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪马科技有限公司）；T⁃1000 型电子天平［美国双杰兄弟（集团）有限公司］；AB265⁃S 电子分析天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；PH 计（奥豪斯仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 落新妇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号11798⁃201504，纯度93.9%）。海风藤、石楠藤、细辛、干姜、姜黄、丁香、肉桂、川乌、土茯苓、山慈菇、蜈蚣、土鳖虫、冰片均由昆明市中医医院提供（有检验报告），经专家鉴定为正品。卡波姆980（青岛天力源生物科技有限公司）；甘油（天津市申泰化学试剂有限公司）；吐温80（天津市博迪化工有限公司）。甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 挥发油 以出油率、干膏得率计算综合评分（Z1），考虑到本实验以提取挥发油为主，故设定两者权重系数分别为0.7、0.3，公式为Z1＝（出油率／最大出油率）×70 ＋（干膏得率／最大干膏得率）×30。其中，出油率＝（挥发油质量／饮片质量）×100%，干膏得率＝（已恒重的膏质量／对应饮片质量）×100%。

按处方比例取3 份含挥发油的饮片（海风藤、石楠藤、细辛、干姜、姜黄、丁香、肉桂、川乌，虽然川乌不含挥发油，但并入挥发油提取中进行先煎），每份70 g，加10 倍量水，于0～75 min内每15 min 测定1 次吸水率，发现最佳浸泡时间为60 min，平均吸水率为108.08%（RSD ＝2.49%）。以Z1为评价指标，单因素试验考察提取时间（1、2、3、4、5 h）、料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30）对挥发油提取的影响，结果见图1，可知最佳提取时间为3 h，料液比为1 ∶20，出油率（n＝2）为3.52%。

图1 各因素对挥发油提取工艺的影响Fig.1 Effects of various factors on the extraction process for volatile oils

2.1.2 药材 按处方比例取3 份不含挥发油的饮片（土茯苓、山慈菇、蜈蚣、土鳖虫），每份40 g，加10 倍量水，于0～75 min 内每15 min 测定1 次吸水率，确定最佳浸泡时间为45 min，吸水率为105.02%（RSD＝4.27%）。

以干膏得率、落新妇苷于饮片至水提液中的转移率计算综合评分（Z2），其中干膏得率＝（已恒重膏质量／对应饮片质量）×100%，落新妇苷转移率＝（提取液中落新妇苷含量／饮片中落新妇苷含量）×100%（饮片中落新妇苷含量按2020 年版《中国药典》方法测定），两者权重系数分别为0.486、0.514。

取落新妇苷对照品适量，加甲醇制成100 μg／mL溶液，按处方比例取不含挥发油的饮片80 g，提取，合并滤液，浓缩，定容至100 mL，移取10 mL，加等体积水饱和正丁醇萃取4 次，萃取液减压回收溶剂至干，加甲醇定容至10 mL，滤过，作为供试品溶液，同法制备阴性样品溶液。分析条件为C18色谱柱；流动相甲醇⁃0.5% 冰醋酸（28 ∶72）；体积流量1 mL／min，柱温30 ℃；检测波长291 nm；进样量10 μL。以落新妇苷质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝22.98X＋4.84（r＝0.999 9），在20.85～208.46 μg／mL 范围内线性关系良好，精密度、稳定性（16 h 内）、重复性试验所得RSD 均＜2.0%，平均加样回收率（n＝6）为104.10%，RSD为2.04%。图2 显示，该方法专属性良好。

图2 落新妇苷HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of astilbin

结合预试验结果和相关文献，选择料液比（A1）、提取时间（B1）、提取次数（C1）作为影响因素，Z2作为评价指标，3 因素3 水平正交试验优化水提工艺，结果见表1，方差分析见表2。由此可知，各因素影响程度依次为C＞B＞A，其中C有显著影响（P＜0.05），并且该因素K3、K2相差较小，从实际生产成本考虑，选择提取2 次。最终确定，最优工艺为料液比1 ∶10，提取时间1.5 h，提取次数2 次。

表1 正交试验设计与结果Tab.1 Design and results of orthogonal tests

表2 正交实验方差分析Tab.2 Analysis of variance for orthogonal tests

2.1.3 验证试验 按“2.1”“2.2”项下优化工艺进行3 批验证试验，测得含挥发油药材平均干膏得率为13.57%（RSD ＝1.53%），出油率为3.55%（RSD ＝0.99%），而不含挥发油药材两者分别为16.24%（RSD ＝3.76%）、47.70%（RSD ＝2.96%），表明该工艺稳定可靠。

2.2 浓缩、干燥工艺优化 以提取液⁃浓缩液、浓缩液⁃干膏环节单元的落新妇苷保留率为指标，分别对常压、减压浓缩和干燥工艺进行考察，测定落新妇苷平均保留率，公式为保留率＝（浓缩或干燥后中间体中对应1 g 土茯苓所含落新妇苷含量／浓缩或干燥前中间体中对应1 g 土茯苓所含落新妇苷含量）×100%，结果见表3。由此可知，减压浓缩［（80± 5）℃、（0.07 ± 0.01）MPa］、减压干燥［（80±5）℃、（0.06±0.01）MPa］效果最佳。

表3 落新妇苷保留率测定结果（n＝2）Tab.3 Results of retention rate determination of astilbin（n＝2）

2.3 成型工艺优化

2.3.1 评价指标 以凝胶黏度、外观性状、载药量、保湿性为评价指标（Z3），进行成型工艺优化。

2.3.2 权重系数计算

2.3.2.1 AHP 法 选择黏度、外观性状、载药量、保湿性作为评价指标，其中前三者采用主观评分的方式评价，各指标重要性依次为黏度＝外观性状＞载药量＞保湿性，建立成对对比矩阵A，将矩阵中各数值除以对应列的和，并对所得结果各行求和，得到单列结果，再将该列结果各数值除以列和，得到矩阵B［7］，矩阵中各数值至上而下，分别对应黏度、外观性状、载药量、保湿性，权重（Wj）分别为0.354、0.354、0.161、0.131。具体如下。

再通过AHP 法计算指标权重的一致性检验，按λ ＝（1／n）［（AB）i／Bi］、CI ＝（λ－ n）／（n－1）、CR ＝CI／RI分别求得最大特征根λ为4.021，一致性指标CI为0.007，一致性比率CR为0.008 ＜0.1（n＝4 时，随机一致性指标RI＝0.90），表明所得权重可靠性较高。

2.3.2.2 CRITIC 法 对表3 各指标的量值进行标准化处理，得到标准矩阵，公式为［（指标值－最小指标值）／（最大指标值－最小指标值）］ ×100%。通过SPSS 18.0 软件进行因子分析，求得相关系数矩阵C。具体如下。

再计算对比强度（σj）、冲突性（Rj）、综合权重（Hj）、权重（Wj）［8］，公式分别为σj＝结果见表4。由此可知，黏度、外观性状、载药量、保湿性的的权重系数分别为0.306、0.185、0.249、0.260。

表4 各指标权重的相关参数Tab.4 Related parameters for the weights of various indices

2.3.2.3 AHP⁃CRITIC 混合加权法 采用混合加权法计算各指标复合权重系数（Wf），公式为Wf＝Wj⁃AHPWj⁃CRITIC／∑Wj⁃AHPWj⁃CRITIC，测得黏度、外观性状、载药量、保湿性Wf分别为0.437、0.264、0.162、0.137，再通过SPSS 18.0 软件对AHP、CRITIC 法所得Wj进行相关性分析，发现相关系数为－0.113，表明2 种赋权方法存在较大差异。同时，对表6 中AHP、CRITIC、AHP⁃CRITIC 法所得综合评分进行相关性分析，发现AHP 与CRITIC、AHP 与 CRITICAHP⁃CRITIC、CRITIC 与 AHP⁃CRITIC 的相关系数分别为0.969、0.992、0.955，表明3 种赋权方法具有一致性，所得Wf可靠［9⁃10］。

2.3.3D⁃Optimal 设计 结合文献中的凝胶基础处方和预实验结果，筛选出挥发油、干膏、冰片总质量（A2）为17～27 g（三者按处方比例使用，比例17 ∶2 ∶63），Tween⁃80 用量（B2）为0.5～1.5 g，甘油用量（C2）为5～10 g，卡波姆980（先用50 mL 20% 丙二醇溶胀14 h）用量（D2）为2～4.6 g。按上述方法溶胀卡波姆980，并加入Tween⁃80、甘油搅拌均匀，再依次加入干膏、冰片、挥发油、尼泊金乙酯（固定其用量为0.40 g），研钵研匀，加三乙醇胺调pH 至7.0±0.5（测定pH 时将凝胶调配为10%溶液），制备消瘤止痛凝胶。

以凝胶黏度、外观性状、载药量、保湿性的综合评分（Z3）为评价指标（表5），通过Design⁃Expert 8.0.6 软件进行D⁃Optimal 设计，计算凝胶载药量，公式为载药量＝（A2／制得凝胶总质量）×100%，结果见表6，结合方差分析可知模型P＜0.000 1，失拟项P＝0.598 ＞0.05，R2＝0.995 0，回归方程为Z3＝62.00A＋48.06B＋58.99C＋77.96D－8.41AB＋51.20AC＋58.96AD＋43.17BC＋72.73BD＋64.10CD－ 80.38ABC＋814.66ABD－ 258.35ACD－434.63BCD。最终确定，最优处方为挥发油、干膏、冰片总质量19.96 g，Tween⁃80 用量0.77 g，甘油用量5.00 g，卡波姆980 用量3.12 g，Z3为108.85 分。3 批验证试验中，Z3平均值为112.63分（RSD＝5.42%），与预测值108.85 分接近（相对误差3.47%），表明该处方及制备方法稳定可靠［11⁃12］。

表5 各评价指标的评分标准Tab.5 Scoring standards for various evaluation indices

表6 D⁃Optimal 设计结果Tab.6 Results of D⁃Optimal design

3 讨论与结论

消瘤止痛方含挥发油药味较多，如石楠藤、干姜、姜黄等含轻油，肉桂、丁香含重油，同时，不含挥发油的药味长时间加热时不利于有效成分的保留（如君药土茯苓中的落新妇苷），故本实验未全方提取挥发油，而是将提取挥发油后所剩药渣与方中水提药味合并后考察水提工艺，从而保障本方疗效。方中蜈蚣、土鳖虫、山慈菇、海风藤、石楠藤在2020 年版《中国药典》 中未收录“含量测定”项，暂不作为评价指标；丁香、肉桂含有挥发油，故不宜作为评价指标；细辛中细辛酯素、干姜中6⁃姜辣素、姜黄中姜黄素在水提液中的峰面积过小，也不适合列入评价指标；2020 年版《中国药典》 规定，川乌中苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱总含量不得低于0.01%，而本方中该药材用量仅为全方的1／12，经计算三者总含量均不足全方总量的十万分之一，数值过低导致也无法将其作为评价指标；冰片不参与提取，最终确定君药土茯苓中落新妇苷为评价指标。另外，在提取过程中落新妇苷平均转移率偏低，仅为47.70%，可能与该成分热不稳定，并与方中其他药味所含成分发生反应有关，具体原因有待进一步探索。

由于成型工艺中干膏、挥发油、冰片的投料比是固定的（由处方决定），故本实验将三者总投料量作为一个影响因素，并结合凝胶基质处方中各物料用量作为D⁃Optimal 设计中的自变量进行优化。D⁃Optimal 设计可在具有多个自变量的情况下减少试验次数，同时使结果更合理，相较于正交设计更为可靠，与星点设计相比也更加便捷。

综上所述，本实验对消瘤止痛凝胶提取、浓缩、干燥、成型工艺进行了系统研究，并筛选出稳定的制备工艺，可为该制剂的剂型改进、临床推广、生产工艺规程制定奠定基础。