基于网络药理学分析黄芩-槐花药对治疗高血压的作用机制*

管怡晴，陈凯，田元新，全东令，张静茹，吕琳，张国华

(南方医科大学1.中医药学院；2.药学院，广州 510515)

“黄芩-槐花”药对是张国华教授在多年临床实践中，用于治疗高血压的常用配伍组合，其临床降压疗效明确，然而目前关于“黄芩-槐花”配伍组合对高血压作用机制的研究笔者尚未见报道，因此，笔者在本研究探讨其对高血压作用的潜在机制，为临床应用提供科学依据。

黄芩始载于《神农本草经》，为唇形科多年生草本植物黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，其味苦、性寒，具有清热燥湿、止血安胎、泻火解毒等功效[1]。黄芩主要含有黄酮及其苷类，如黄芩苷、黄芩素、白杨素等[2]。现代药理研究表明，黄芩苷在治疗高血压、减少心脏胶原沉积并改善心脏重构、改善胰岛素敏感性等方面有明显效果[3-5]。白杨素具有降压、改善心肌损伤、糖尿病肾病[6-8]等作用。黄芩素可通过抗氧化应激、抑制蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)及多元醇通路的激活、抑制炎症递质、降压、降脂等途径拮抗高血糖所导致的代谢紊乱，起到肾脏保护作用[9]。槐花出自《日华子本草》，为豆科植物槐(SophoraJaponicaL.)的干燥花蕾及花[10]，其味苦，性微寒，能清肝泻火，凉血止血。山奈酚、芦丁、异鼠李素、槲皮素等是槐花的主要有效成分[11]。研究表明，山奈酚具有调节脂质改善肥胖、抗凝血、抗癌等功效[12-14]。芦丁具有抗病毒、抗氧化和抗炎等作用[15-16]。异鼠李素不仅有抗炎作用[17]，还可以通过抑制生长转化因子(transforming growth factor，TGF)-β信号通路改善肝纤维化和降低氧化应激水平[18]。在“黄芩-槐花”药对配伍应用中，槐花以凉血为主，黄芩以泻火为要，二者配伍，可使苦寒泻热、凉血降压的力量增强，临床上适用于肝火亢盛的高血压患者。本研究将采用网络药理学和分子对接技术揭示“黄芩-槐花”药对治疗高血压的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 数据来源于中药系统药理学分析平台(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；UniProt蛋白数据库(https：//www.uniprot.org/)；治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；OMIM数据库(http：//www.omim.org/)；CTD数据库(http：//ctdbase.org/)；Genecards数据库(https：//www.genecards.org/)；VENNY2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )在线工具；Metescape(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；RSCB PBD数据库 (http：//www.rcsb.org/) ；Sybyl 7.3 软件；Cytoscape3.6.0软件。

1.2方法

1.2.1“黄芩-槐花”候选化合物筛选与作用靶点分析 在TCMSP中检索“黄芩”“槐花”的化学成分，进行口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 和类药性(drug likeness，DL) 分析( TCMSP 网站标准：OB≥30%且DL≥0.18) 收集筛选“黄芩”“槐花”候选化合物，并检索及其相关靶点，在UniProt数据库中得到对应的官方名称，使用Cytoscape软件建立药物的“活性成分-作用靶点”网络模型[19-20]。

1.2.2高血压相关靶点预测 从TTD、OMIM、CTD和Genecards数据库检索高血压疾病靶点，通过UniProt数据库得到对应的官方名称。利用VENNY2.1在线工具将“黄芩-槐花”和高血压矫正后的靶点基因取交集。

1.2.3“黄芩-槐花”治疗高血压的化合物-靶点网络的构建 查找交集靶点基因在“黄芩-槐花”中对应的候选化合物，使用Cytoscape软件构建药对治疗高血压的“活性成分-作用靶点”网络模型，并通过Network analyze插件筛选节点较多的关键化合物和作用靶点。

1.2.4作用靶点蛋白功能归属和通路注释分析 利用Metescape平台对交集基因进行作用靶点蛋白功能归属，探讨“黄芩-槐花”参与调节高血压的物质类型。同时在平台上将输入物种和分析物种均设置为“H.sapiens”，设置P<0.01，对作用靶点进行GO注释分析及KEGG通路分析。

1.2.5分子对接 选取“黄芩-槐花”治疗高血压的“活性成分-作用靶点”网络中度值≥5的化合物，与高血压相关靶点进行分子对接。化合物用Sybyl 7.3[21]中sketch模块构建，添加Gasterger-Huckel 电荷，加氢后用Tripos力场优化，得到最低能量构象，收敛标准为0.004 kJ/( mol·A)。从PDB库中下载高血压靶点蛋白的晶体结构，登录号：3NOS，1UZF。采用Sybyl 7.3中的Surflex-Dock程序进行分子对接。本研究中选取与原配体对比后，结合作用较好的有代表性的化合物进行分析。

1.2.6动物实验 异鼠李素(isorhamnetin，ISO)和苏荠黄酮(moslosooflavone，MOS)均购于成都克洛玛生物科技有限公司；卡托普利(captopril，CAP)购于广东彼迪药业有限公司，批号：H44021595。16周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hyertensive rat，SHR)24只和雄性无特定病原体(SPF)级京都种大鼠(wistar-kyoto rat，WKY)6只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，实验动物合格证号：20160167。采用随机数字分法，将SHR大鼠分为4组，包括高血压模型组(SHR)、异鼠李素组(ISO组，150 mg·kg-1·d-1)、苏荠黄酮组(MOS组，150 mg·kg-1·d-1)及卡托普利组(CAP组，13.5 mg·kg-1·d-1)，另设正常血压对照组(WKY组)，连续给药6周。

1.2.7大鼠血压检测 使用无创血压测量分析系统仪(型号：ALC-NIBP)，每周检测各组大鼠尾动脉收缩压和舒张压，取其连续3次平均值作为其平均血压值。

1.2.8大鼠血清中血管内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的检测 各组大鼠给药6周后，尾静脉取血，收集血清，用大鼠eNOS 酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司，批号：CSB-E08323r)检测eNOS；ACE的ELISA试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司，批号：CSB-E04490r)检测ACE。

1.2.9蛋白免疫印迹法检测大鼠内皮中eNOS蛋白水平的表达 用组织匀浆机和超声破碎仪将血管内皮组织研磨至均质液体，4 ℃，12 000×g离心30 min，取上清液，并用BCA 试剂盒测定蛋白含量。每孔上样量为40 μg，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶电泳分离，电转2 h至孔径0.45 μm聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，eNOS(武汉博士德公司，批号：EK0697)一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST 洗膜4 次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜4 次后，FluorChem R 多功能成像分析系统进行显影，用Image J 软件进行图像分析。

2 结果

2.1“黄芩-槐花”药对的活性成分 通过OB≥30，DL≥0.18的标准筛选后，“黄芩-槐花”中有41个化合物具有较好的OB和DL，将其作为候选化合物，结果见表1。在黄芩活性成分中，OB最高为黄芩新素(neobaicalein，OB=104.34%)，DL最高为黄连碱(coptisine，DL=0.86)，大多数黄酮类化合物均有较高OB值和DL值，如降穿心莲黄酮(panicolin，OB=76.26%，DL=0.29)，黄芩总黄酮Ⅱ(skullcapflavoneⅡ，OB=69.51%，DL=0.44)，苏荠黄酮(moslosooflavone，OB=44.09%，DL=0.25)等，目前广泛应用于临床，可用于治疗心血管及代谢性疾病。符合筛选条件的槐花化合物中，OB最高为异鼠李素(isorhamnetin，OB=49.6，DL=0.31)，DL较高为N-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide(DL=0.78)此外，山奈酚(kaempferol)具有抗肿瘤、抗炎作用[22]，能改善小鼠模型心功能障碍和心肌纤维化[23]。

2.2“候选活性化合物-作用靶点”网络模型 41个候选活性化合物与作用靶点的网络模型，见图1。因4个化合物在数据库中尚无作用靶点(表1)，故构建网络模型中包含264个节点(37个化合物和227个潜在靶点)和766条边。在网络中，红色节点代表分子，蓝色节点代表靶点，节点大小代表度值(degree)的大小，每个节点的度值表示网络中和节点相连的边的条数。如每一个红点的度值代表候选化合物所拥有的靶点数目；而每一个蓝点的度值则代表着相应靶点所对应的相关化合物数目。图1中，分子0098(槲皮素，quercetin)的作用靶点最多(degree=154)，接着是0422(山奈酚，kaempferol)(degree=63)，0173(汉黄芩素，wogonin)(degree=44)等，这些化合物具有较多的作用靶点，可能在该药对的药理功能中起到较为核心的作用。在作用靶点方面，前列腺素G /H 合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2，degree=31)，前列腺素G /H 合成酶1(prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1，degree=28)，热休克蛋白(heat shock protein HSP 90，HSP90，degree=28)，有较多的化合物配体。在227个潜在靶点中，至少有111个靶点与2个或以上的化合物相连，根据表1的度值，在网络模型中，至少有33个化合物都与≥3个作用靶点相连接，说明“黄芩-槐花”具有多成分、多靶点的复杂性。

图1 候选化合物与靶点相互作用网络图

表1 通过OB和DL预测的41个候选化合物

2.3“黄芩-槐花”作用靶点蛋白的功能归属及化合物-靶点网络的构建 从4个数据库中收集高血压相关基因与“黄芩-槐花”的作用靶点取交集后共得到45个靶点，包括一氧化氮合酶3、血栓调节蛋白、肾上腺素受体β2等。表2为Metascape数据库中45个靶点对应的蛋白功能，表明转录因子、受体、酶、离子通道等物质参与“黄芩-槐花”治疗高血压的过程。交集靶点对应的化合物信息见表3，其度值(degree)代表化合物所对应的高血压靶点的数目。“黄芩-槐花”治疗高血压的相关化合物及靶点网络模型见图2，构建网络模型中包含71个节点(26个化合物和45个潜在靶点)和142条边。在网络中，红色菱形节点代表靶点，绿色三角形节点代表化合物。

图2 “黄芩-槐花”治疗高血压的活性成分-靶点网络图

表2 45个高血压靶点的蛋白功能

续表2 45个高血压靶点的蛋白功能

表3 45个高血压靶点对应的26个化合物

2.4基因功能和通路富集分析 GO注释分析可描述基因生物学功能，由分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP) 和细胞组成(cellular component，CC) 三个部分组成。其中，分子功能分析(图3A) 主要是蛋白磷酸酶结合、肾上腺素能受体活性、蛋白质异源二聚反应活性、细胞因子受体结合等几个靠前；生物过程(图3B) 中排名靠前的有：循环系统中的血管过程、活性氧代谢过程、细胞因子介导的信号通路、细胞对有机含氮化合物的反应等；而在细胞组成 (图3C) 分析中靠前的主要是细胞膜、细胞外基质、质膜外侧、轴突、肌膜等。

KEGG pathway 富集分析发现45个靶点涉及17条通路(图3D)，包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信号通路、钙信号通路、Apelin信号通路、肥厚型心肌病等。

A.分子功能；B.生物过程；C.细胞组成；D.KEGG通路。

2.5分子对接 结果表明异鼠李素作用于eNOS靶点；苏荠黄酮作用于ACE靶点；分子间的相互作用见图4，绿色条带为蛋白质，黄色虚线为氢键作用。其中异鼠李素与eNOS原配体的结合方式最相似，一方面与活性口袋中的ARG365以及ALA446形成氢键，另一方面，与eNOS形成π-π堆积作用，表明异鼠李素与eNOS的结合作用较好。 苏荠黄酮与ACE的活性口袋中的HIS513、TYR520、GLN281均形成氢键，和卡托普利结合ACE的方式相似。

2.6体内实验 结果见图5。与正常对照组比较，SHR组大鼠收缩压和舒张压均显著升高 (P<0.01)，而ISO和MOS治疗后均能降低大鼠的收缩压和舒张压 (P<0.01)，提示ISO和MOS均有一定的降压作用。

A.异鼠李素的化学结构；B.苏荠黄酮的化学结构；C.异鼠李素与eNOS的结合位点；D.苏荠黄酮与ACE 的结合位点。

ELISA结果显示，SHR组大鼠血清及内皮中的eNOS水平显著低于WKY组，而ACE水平高于WKY组(图5C-5F)，治疗后发现，ISO能有效升高eNOS的水平(P<0.01)，MOS则明显降低ACE的水平(P<0.01)。

3 讨论

中药治疗原发性高血压具有一定优势，在一定程度上能起到补充治疗的作用[24]。本研究利用网络药理学首次构建 “黄芩-槐花”药对治疗高血压的“化合物-靶点”网络图，网络包含71个节点，142条边，体现成分和靶点之间的复杂作用。

GO分析发现黄芩、槐花治疗高血压主要生物过程涉及循环系统中的血管过程、活性氧代谢过程、细胞因子介导的信号通路等方面。分子功能涉及蛋白磷酸酶结合、肾上腺素能受体活性、蛋白质异源二聚反应活性、细胞因子受体结合等方面。细胞组成涉及细胞膜、细胞外基质、轴突、肌膜等方面。

KEGG通路富集结果表明，药对治疗高血压的作用机制与包括HIF-1信号通路、钙信号通路、Apelin信号通路在内的17条信号通路相关，与现有研究结果报道一致：HIF-1的持续升高会损伤血管内皮，引起血管生成障碍及影响血管壁完整性，导致血压升高；作为第二信使的细胞内钙离子，能调控细胞的生存和凋亡，同时调节机体的生理病理过程。钙离子拮抗剂(calcium channel blockers，CCB)也是临床常用的降压药物，CCB可通过阻断L型钙通道降低血管阻力，减少血压的变异性[25]；Apelin可刺激一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成，从而舒张血管，降低血压。上述结果提示，“黄芩-槐花”药对通过多途径在高血压病理发展过程中起调节作用。

①与WKY组比较，P<0.01；②与SHR组比较，P<0.01；③与SHR组比较，P<0.05。

进一步对17条信号通路分析后，笔者选取与多条通路有相互作用的重要基因—人血管内皮型一氧化氮合酶(PDB ID：3NOS)作为分子对接的靶点蛋白，以晶体结构中自带配体为阳性对照，进行分子对接实验。同时选取临床一线降压药物血管紧张素转化酶抑制剂的作用靶点，即血管紧张素转化酶(PDB ID：1UZF)作为分子对接的第二个候选靶点，分析筛选药对中作用于这两个靶点的活性成分。结果表明，槐花中的异鼠李素与eNOS靶点作用力强，黄芩中苏荠黄酮与ACE靶点结合性好，提示二者可能起协同作用。它们可通过氢键、π-π堆积、疏水作用等与靶点蛋白结合，在一定程度上揭示了药对的分子作用机制。

动物体内实验验证表明，异鼠李素和苏荠黄酮均能降低自发性高血压大鼠的血压，且异鼠李素可增加大鼠血清及内皮中的eNOS表达，苏荠黄酮可降低血清ACE水平，与分子对接靶点预测结果相符。

综上所述，本研究应用网络药理学方法、分子对接、信号通路富集等多种方法对“黄芩-槐花”药对的化学成分、作用靶点和治疗高血压的作用机制进行探索性研究，并利用动物体内实验进行初步验证。本研究符合转化医学的宗旨，从临床工作中发现并提出问题，旨在阐明“黄芩-槐花”药对治疗高血压的物质基础和分子机制，为其临床应用提供科学的实验依据和数据支持。

此外，异鼠李素和苏荠黄酮只是“黄芩-槐花”中众多成分之一，其体内实验结果表明二者能明显作用于降压靶点，首次在一定程度上说明其均为“黄芩-槐花”药对中的物质基础，但由于中药成分复杂，仍需要对“黄芩-槐花”多种单体进行药效学研究及机制探索。同时，本实验未考虑药物在煎煮过程中可能发生的化学反应及药物成分的变化，将在下一步实验中进行中药血清药物化学的研究，以期解决药物成分变化的问题，为“黄芩-槐花”的临床应用及安全性分析提供数据参考。