高龄孕妇羊水染色体核型分析及拷贝数变异分析

2021-06-13颜梅珍王元白江矞颖庄建龙

西南医科大学学报 2021年2期

张娜，颜梅珍，王元白，江矞颖，庄建龙

（泉州市妇幼保健院·儿童医院产前诊断中心，福建泉州 362000）

我国新生儿出生缺陷发生率约5.6%，染色体异常为其发生的重要原因[1]。对产前高危孕妇进行羊水穿刺产前诊断是检测胎儿染色体异常最直接、有效、不可替代的检测手段。高龄孕妇是产前临床咨询常见的高危群体，高龄可造成卵巢功能衰退，卵子逐渐老化以及环境因素的累积，使生殖细胞或受精卵在减数分裂时期发生染色体不分离的风险增加[2]。另外，随着我国“全面二胎”政策的开放，孕妇年龄呈增高趋势，胎儿染色体异常发生率也随之升高[3]。因此，对高龄孕妇进行产前胎儿染色体检测具有重要意义。

传统染色体核型分析技术，目前仍是较为常规的细胞遗传学检测方法，但其分辨率较低，检测时间较长，仅可检测≥5 Mb的遗传物质改变[4]。染色体微阵列分析是一种高分辨率的全基因组技术，用于鉴定染色体异常，包括常规细胞遗传学技术能够检测到的异常，以及小的亚显微缺失和重复的染色体拷贝数变异（copy number variations，CNVs）。CMA 技术包括基于微阵列的比较基因组杂交技术和单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技术。SNP array技术不仅能够扫描全基因组拷贝数变异，还能够识别杂合性缺失、单亲二倍体和三倍体[5-7]。目前，该技术已被推荐作为胎儿超声结构异常的一线检测技术[8]，但在高龄孕妇中的应用研究相对较少。

本研究通过回顾性分析2018年1月至2020年7月至泉州市妇幼保健院行产前诊断的高龄孕妇1 338例，探讨高龄孕妇胎儿染色体异常检出情况，同时分析高龄孕妇胎儿染色体拷贝数变异检出情况，探讨染色体微阵列技术在高龄孕妇产前诊断中的应用价值，为临床咨询提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至2020年7月泉州市妇幼保健院产前诊断中心行产前诊断的高龄孕妇共1 338例，其中孕周18～25+6周，年龄35～52岁。本研究经泉州市妇幼保健院·儿童医院伦理委员会批准（2019No.13和2020No.31）。

1.2 羊水穿刺

对所有高龄孕妇进行临床咨询，签署知情同意书后行产前羊水穿刺。孕妇术前排尽膀胱，仰卧位，充分暴露腹部，通过超声确定胎儿位置，用5 mL 注射器抽取2 mL弃去，后更换10 mL注射器，抽取实验所需羊水20～30 mL。羊水抽取后超声医生再次观察胎儿心率及胎盘情况，并嘱孕妇观察半个小时后离开医院。

1.3 羊水细胞培养及羊水染色体核型分析

将羊膜腔穿刺获得的20 mL羊水，分装在2个无菌刻度离心管中。离心弃上清，分别接种于两种不同的羊水培养基中，进行羊水细胞培养。当有大量圆形发亮细胞出现时，加胰酶消化进行收获，采用染色体自动收获系统Sinochrome ChromprepⅡ（上海乐晨生物科技有限公司）进行染色体制备，经吉姆萨染色后进行核型分析。每个羊水样本至少计数30个，分析5个核型。

1.4 羊水DNA提取及SNP array检测

将抽取的羊水10 mL 使用QIAamp DNA Blood Kit（QIAGEN）试剂盒行羊水DNA提取。使用Affyme⁃trix CytoScan 750K芯片进行全基因组拷贝数变异分析。通过DGV，OMIM，DECIPHER，Pumed 等数据库进行检索，进行拷贝数变异临床意义判断。拷贝数变异致病性的判读参照美国医学遗传学学会指南[9]。

1.5 统计学分析

利用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计数资料以率表示，采用χ2检验进行比较，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高龄孕妇染色体核型结果

共1 338 例高龄孕妇进行产前诊断胎儿细胞染色体核型分析，3例培养失败，成功率约99.76%（1 335/1 338）。1 335例胎儿核型分析检测结果显示，共检出染色体异常159 例，包括102 例T21，15 例T18，2 例T13 和30 例性染色体非整倍体，染色体结构异常8例，染色体嵌合2 例，见表1。染色体异常检出率为11.91%（159/1 335），其中染色体非整倍体异常占总异常检出93.71%（149/159）。

表1 高龄孕妇胎儿染色体核型结果

2.2 高龄合并不同高危因素间染色体异常检出情况

本研究进一步分析了高龄合并不同高危因素时染色体异常检出情况，见表2。结果显示，高龄合并不同高危因素时染色体异常检出率差异具有统计学意义（χ2=323.113，P<0.001）。其中，单纯高龄组染色体异常检出率为4.42%（37/838），当高龄合并NIPT高风险或两项及以上高危因素时，染色体异常检出率较高，分别为54.62%（65/119）和61.54%（16/26），而高龄合并不良孕史时染色体异常检出率最低（2.97%）。

表2 高龄合并不同高危因素组间染色体异常检出情况

2.3 高龄孕妇SNP array检测结果

本研究中，207 例高龄孕妇同时行SNP array 检测及染色体核型分析。如表3所示，染色体核型分析及SNP array 技术均能有效检出染色体非整倍体（T21，T18及性染色体数目异常）。另外，SNP array技术较核型分析多检出3例致病性CNVs（1例Xq28微重复，1 例17p13.3 微重复和1 例22q11.2 微缺失）见图1，同时，明确了1例小标记染色体的来源。SNP ar⁃ray 技术还检出20 例临床意义不明拷贝数变异（variants of unknown significance，VOUS）。结果显示，SNP array技术较染色体核型分析额外检出1.45%（3/207）致病性CNVs。另外，核型分析较SNP array 技术额外检出2例染色体平衡易位。

表3 高龄孕妇SNP array检测结果

图1 SNP array检测结果

2.4 妊娠结局及生后随访

本研究对207例行SNP array检测孕妇进行妊娠结局及生后随访显示，失访14 例，随访率约93.24%(193/207)。其中染色体核型分析及SNP array 检测均正常共162例，失访5例，其余均继续妊娠，生后随访体健。18 例染色体非整倍体及5 例携带染色体致病性CNVs均选择终止妊娠，而2例染色体平衡易位携带者选择继续妊娠，生后随访体健。此外，20例携带VOUS 的孕妇中，5 例失访，5 例选择终止妊娠，10 例继续妊娠，生后随访体健。

3 讨论

高龄孕妇是产前诊断的重要对象，随着“全面二胎”政策的开发，高龄孕妇随之增加，同时也伴随着胎儿染色体异常的风险。因此，进行积极的临床咨询及产前诊断尤为关键。本研究通过回顾性分析1 335例高龄孕妇产前诊断结果，探讨高龄孕妇胎儿染色体核型异常及拷贝数变异检出情况，为临床咨询提供参考数据。

本研究中，1 335例高龄孕妇胎儿染色体核型分析结果显示，共检出染色体异常159例，染色体异常检出率为11.91%，与麦明琴等[10]报道的高龄孕妇染色体异常检出率（10.8%）一致，但高于其他相关研究[11-12]。另外，染色体异常以非整倍体检出为主，占总异常检出93.71%。该结果可能与高龄导致卵巢功能衰退，从而使生殖细胞或受精卵在减数分裂时期发生染色体不分离的风险增加，导致胎儿染色体非整倍体。另外，也可能与女性特有的“交叉成熟缺陷”造成染色体重组交换错误，从而导致胎儿非整倍体相关[13]。

为了分析高龄合并不同高危因素时染色体异常检出是否存在差异，我们进一步对高龄合并不同高危因素进行分组研究。结果显示不同组间染色体异常检出率差异具有统计学意义。其中，单纯高龄组染色体异常检出率较低（4.42%），当高龄合并其他高危因素时，胎儿染色体异常检出均大幅增加，而当高龄合并不良孕史时染色体异常检出率降低2.97%。当高龄合并NIPT高风险时，胎儿染色体异常检出率较高（54.62%），该结果与NIPT高风险胎儿染色体异常检出率相关研究一致[14-15]。因此，本研究进一步提示了NIPT技术是一种十分有效的产前筛查手段。

本研究中，207 例高龄孕妇同时行SNP array 检测及染色体核型分析。SNP array 技术能有效检出染色体非整倍体，检出率为100%。同时，SNP array技术较核型分析多检出3 例致病性CNVs，提高致病性CNVs 检出率约1.45%。同时，SNP array 技术能够帮助明确标记染色体的来源。本研究SNP array 检出1例17p13.3微重复，内含PAFAH1B1等26个OMIM基因，该基因突变/缺失与无脑回畸形疾病相关，临床表型包括小头畸形，发育迟缓，智力障碍，轴向肌张力减退，痉挛性四肢截瘫，癫痫等。有研究报道在无脑回畸形等表型异常的患者中检测到累及PA⁃FAH1B1 基因的17p13.3 区段的重复[16]。胎儿同时合并多项超声指标异常，经充分临床咨询，孕妇及家属选择终止妊娠。另外，本研究检出1例Xq28微重复，内含CLIC2，RAB39B等10个OMIM基因，累及Xq28重复综合征，临床表型包括认知障碍，行为异常，复发性感染，肥胖，面容异常等，但女性携带者可能呈现较轻表型，本次妊娠胎儿为女性，经遗传咨询可能出现较轻微症状，孕妇及家属选择继续妊娠。本研究检出1 例22q11.21 微缺失，累及22q11.2 缺失综合征，22q11.2缺失综合征也被称为DiGeorge综合征或者腭心面综合征等，为常染色体显性遗传，约93%的异常为新发生，约7%的异常为遗传自父母[17]。临床表型包括先天性心脏病，腭裂，面容异常，认知障碍，免疫缺陷等。经充分临床咨询，孕妇及家属选择终止妊娠。

目前，随着染色体微阵列技术在产前诊断的不断应用，该技术已经逐渐取代了传统染色体核型分析技术。2013年美国ACOG（american college of obste⁃tricians and gynecologists committee）将该技术推荐作为胎儿超声结构异常的一线检测技术[8]。并且，有研究建议在胎儿结构异常和/或死胎的情况下，CMA检测应替代染色体核型分析，同时建议接受羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样的孕妇均应同时选择CMA 检测和传统染色体核型分析[20]。一项最新研究也提示所有接受有创穿刺的孕妇行CMA检测的必要性[21]。本研究显示，核型分析较SNP array 技术额外检出2例染色体平衡易位。染色体核型分析能够互补检出SNP array 不能检出的染色体平衡易位、倒位等平衡重组。因此，联合SNP array 技术及染色体核型分析能够提高胎儿染色体异常检出率。

本研究，SNP array 技术检出VOUS 20 例，VOUS检出率约9.66%，与国内的研究报道类似[18]，高于国外报道的VOUS 检出率[19]。本研究20 例VOUS 中，7例行父母芯片验证，3 例遗传自父亲，3 例遗传自母亲，1 例为新发突变。其中，仍有13 例无法明确其致病性，应进一步超声随访，密切关注胎儿表型辅助临床致病性判读。因此，今后仍需要大量临床及随访数据的积累，帮助VOUS的致病性判读。