Micro-CT检测STZ诱导的糖尿病大鼠牙槽骨微结构改变

2021-06-13易子欣姚心雨祝贝贝贲亚琍

西南医科大学学报 2021年2期

易子欣，易婷，姚心雨，祝贝贝，贲亚琍，张雯

（江汉大学医学院口腔医学系，湖北武汉 430000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌不足（1 型糖尿病）或胰岛素抵抗（2 型糖尿病）引起的一组代谢性疾病。糖尿病患者的高血糖环境，诱发结构蛋白和基质分子氧化产生晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs），导致毛细血管病变[1-3]，引发多种并发症。牙周病是涉及牙周支持组织的炎性和破坏性疾病，临床特征包括牙龈炎症、牙周附着丧失、牙周袋形成和牙槽骨吸收。研究表明糖尿病与慢性牙周炎之间有着双向的密切关系[4]。糖尿病可以引发牙周组织氧化应激，进而导致牙周组织的进一步损伤以及牙槽骨的吸收[5-7]。微计算机断层扫描技术（micro computed tomography，Mi⁃cro-CT）可准确有效观察骨组织细微结构，其分辨率达到微米级别，能对小型样本重建并呈现3D 影像，对标本进行定性及定量分析[8]。本实验拟以链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立1 型糖尿病大鼠模型，探讨Micro-CT扫描技术用于观测糖尿病大鼠牙槽骨微结构的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验选用健康雄性Sprague-Dawley 大鼠（5～ 6周龄，体重约200～225 g）8只，赣南医科大学动物中心购入并通过动物伦理审核。STZ 购自德国Boeh⁃ringer Mannheim 公司；乙二胺四乙酸二钠（10%EDTA），苏木素染料，伊红染料（购自美国Sigma 公司）；血糖试纸（购自Miles Australia Pty.Ltd）；4%多聚甲醛（购自中国上海生物工程有限公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD 大鼠随机分为对照组和STZ（糖尿病）组（n=4），自由饮水和摄食，常规饲养一周后进行实验。STZ组大鼠腹腔内注射55 mg/kg STZ[9]，对照组大鼠给予同等体积的0.1 M柠檬酸盐缓冲液。72 h后大鼠空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L 的大鼠被视为糖尿病造模成功。继续饲养12 周，并于第6 周和12 周检测大鼠空腹血糖水平。

1.3 HE染色

处死大鼠，取上颌骨，经生理盐水清洗后，放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。保持组织细胞基本固有物质，并使组织硬化。右侧上颌骨于10%EDTA溶液脱钙8 周。经脱水、包埋制备石蜡切片。选择包括完整的冠、根和牙周组织进行切片（5 μm，中轴方向）。切片放入苏木素染液中浸染5 min，流水冲洗返蓝，再冲洗，后用酒精脱水，伊红染液浸染5 min。400倍光学显微镜下拍摄大鼠上颌磨牙间牙龈乳头部位照片，CaseViewer 2.0进行分析，评估釉牙骨质界（ce⁃mento-enamel junction，CEJ）牙槽嵴顶（alveolar bone crest，ABC）的距离。

1.4 Micro-CT扫描成像分析

使用Micro-CT（SkyScan1176，Bruker，Kontich，比利时）扫描大鼠右侧上颌骨样本。扫描完成后，软件CT analyser 手动选择兴趣区间（Region of interest，ROI）：右侧上颌第一磨牙根分叉区域。软件Datev⁃iewer 对ROI 进行三维重建，观察牙槽骨吸收情况。软件CT analyser对ROI区域的骨小梁结构进行参数测量，测量三次取平均值。主要测量参数包括骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁间距（trabec⁃ular separation，Tb.sp）。CT analyser 像素（pixel size）18 μm，最低灰度阈值（lower grey threshold）95，最高灰度阈值（upper grey threshold）255。

1.5 统计学分析

使用GraphPad Prism 6.0 软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（）表示。两个独立样本均数比较采用独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病模型大鼠的血糖值变化

STZ组大鼠腹腔注射STZ后，第6周和12周分别检测血糖，STZ 组大鼠的空腹血糖水平均≥ 16.7 mmol/L，72 h后空腹血糖水平≥ 16.7 mmol/L，提示造模成功，见表1。正常对照组大鼠空腹血糖水平保持在5.0 mmol/L左右。

表1 STZ诱导糖尿病大鼠模型的不同时间血糖值变化（mmol/L）

2.2 HE染色切片分析大鼠牙槽骨吸收程度

HE染色观察大鼠上颌磨牙间牙槽嵴顶部位，可见正常对照大鼠牙槽骨边缘光滑，牙周膜纤维排列整齐，见图1A。STZ 组大鼠牙槽骨边缘可见明显吸收，牙周膜纤维排列紊乱，牙龈上皮有明显的炎症细胞浸润，见图1B。CaseViewer 2.0 软件测量CEJ-ABC距离，结果显示STZ 组相较正常对照组CEJ-ABC 距离明显增加，差异有统计学意义（t=2.492，P <0.05），见图1C。

图1 大鼠上颌骨磨牙HE染色（×40）

2.3 Micro-CT分析牙槽骨微结构

Micro-CT 扫描大鼠右侧上颌骨样本进行重构后，比较两组牙槽骨吸收程度。可见较正常对照组，见图2A，STZ组大鼠上颌骨磨牙矢状正中面，有明显牙槽骨吸收见图2B。与对照组比较，STZ组骨小梁数目（Tb.N）明显降低（t=4.610，P<0.05），见图2C，骨小梁间距（Tb.sp）明显升高（t=2.678，P<0.05），见图2D。

图2 大鼠右侧上颌第一磨牙Micro-CT 分析

3 讨论

牙周病是多因素疾病，牙周微生物触发的炎症反应是牙周病的关键因素[10]。革兰氏阴性厌氧菌牙龈卟啉单胞菌是成人慢性牙周炎的重要病原体[11]，其主要致病成分脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），导致多种前炎症介质的释放[12]，并通过活化破骨细胞及抑制成骨细胞的成骨功能，加重骨质流失进而引发牙槽骨的吸收[13]。另一方面，慢性牙周炎与糖尿病之间存在密切的双向关系[14-16]。糖尿病引发的牙周高血糖环境，AGEs的形成，组织氧化应激反应的增强，易可活化NF-κB信号途径，导致大量前炎症因子的释放，诱发慢性炎症[17]。高血糖环境导致的免疫-炎症应答紊乱，活化了机体固有免疫系统，上调前炎症介质，进而加重牙周破坏[18]。

本研究采用55 mg/kg STZ腹腔注射，72 h后大鼠的血糖水平≥16.7 mmol/L，血糖追踪12 周，STZ 组大鼠的血糖水平均高于16.7 mmol/L，表明成功建立了糖尿病大鼠模型。链脲佐菌素STZ 是一种广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤的用途[19]，因其可被胰岛β细胞表面的葡萄糖转运蛋白GLUT2 转运至β细胞内，因此对实验动物胰岛β细胞具有特异性损伤，诱导产生1 型糖尿病[20]。对建模12 周后的STZ 组大鼠上颌骨进行HE染色分析，可见STZ组大鼠牙龈呈明显的炎症细胞浸润，牙槽骨边缘观察到骨吸收陷窝，CEJ-ABC较对照组降低。Micro-CT分析显示，STZ组骨小梁数量（Tb.N）下降，骨小梁间距（Tb.sp）较对照组显著升高，扫描成像亦可见明显的牙槽骨吸收。Micro-CT及HE染色结果一致，均呈现了STZ组大鼠牙槽骨吸收。以上结果证实，单纯的血糖水平增高亦可导致大鼠实验性牙周组织破坏。

研究分别采用Micro-CT和HE染色对糖尿病大鼠上颌骨模型进行分析。相较于传统的HE 染色方法，组织进行Micro-CT前不需要脱钙等繁琐的标本处理过程，对样本损伤小。实验中Micro-CT 骨微结构参数选用了骨小梁数量Tb.N 和骨小梁间距Tb.Sp。Tb.N 通过计算单位长度内骨组织与非骨组织的交点数量评价每毫米内的骨小梁数量；Tb.Sp 通过计算骨小梁之间髓腔的平均宽度评价骨小梁间隙。Tb.N和Tb.Sp，通过对松质骨骨小梁结构进行分析，以动态的眼光定量分析STZ诱导的糖尿病大鼠牙槽骨改变。显然，Micro-CT能够通过自身处理软件重构获得骨内部详细的图像，进行精准性定量分析，在骨微结构分析方面具有明显优势。该方法作为一种准确、快速、高分辨率的观测方法，适用于大鼠牙槽骨分析。