龙眼主要活性成分分析方法建立及应用

2021-06-13王元园赵文美曽明唐魏郁梦

西南医科大学学报 2021年2期

王元园，赵文美，李柯，曽明唐，皮超，魏郁梦，赵领

（西南医科大学厅市共建中枢神经系统药物四川省重点实验室，四川泸州 646000）

桂圆（龙眼）是我国南方特色水果，国家卫生部第一批公布的可药食两用的特殊水果。龙眼肉含碳水化合物、黄酮类和酚类等多种营养元素，人们常作为保健食品和滋补药品[1-7]。人体新陈代谢过程中产生的过量自由基，与动脉硬化等多种疾病相关[8-9]。龙眼果肉中的抗氧化能力很大一部分来自龙眼多糖。姜晓坤等[10]研究发现多糖提取物对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基有良好的作用，从自由基学说角度出发认为龙眼具有抗氧化作用。另外，龙眼果肉中的多酚类和黄酮类物质也具有一定的抗氧化、抗衰老作用，被誉为“第七类营养素”[9,11-12]。牛改改等[13]研究发现龙眼提取物多酚含量与其抗氧化能力呈正相关。除此之外，龙眼多糖类物质具有抗肿瘤作用。郑少泉等[14]从龙眼果肉中提取了龙眼多糖，采取体内移植肿瘤的方法，协同环磷酰胺抗肿瘤效果良好。

随着桂圆果肉多种生理功效保健机理逐渐被人们认识，已被人们推崇为“果中圣品”。然而，对桂圆活性成分进行系统研究的文章很少，且缺少系统的含量测定的方法。在《中国药典》中，只对其水分、灰分、性状、浸出物量有明确规定，对其有效成分并无说明。本研究利用紫外分光光度法系统地建立了龙眼各主要成分含量测定方法，并用于测定含龙眼的泸产养生酒中部分成分的含量。

1 材料与仪器

1.1 材料

无水葡萄糖、芦丁、没食子酸标准品购自北京中科质检生物技术有限公司；苯酚、浓硫酸等试剂购自成都科隆化学有限公司；亚硝酸钠试剂购自成都艾科达化学试剂有限公司；硝酸铝试剂购自上海麦克林生化科技有限公司；乙醇(分析纯)、氢氧化钠、碳酸钠等试剂购自成都金山化学试剂有限公司；福林酚购自成都艾科达化学试剂有限公司。

1.2 仪器

TGL-20B 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；FA1104N 型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；A390型紫外可见分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）；SH-2磁力搅拌器（成都华衡仪器有限公司）；艾柯超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）。

2 方法

2.1 总糖

2.1.1葡萄糖紫外吸收行为表征

精密称取无水葡萄糖标准品适量，置于容量瓶中，加水溶解并定容，得无水葡萄糖溶液（质量浓度为2 mg/mL）。取适量无水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，得葡萄糖稀释液。精密量取上述稀释液2 mL 于10 mL 具塞试管中，加入5%苯酚溶液（新制）1 mL，并迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，40 ℃水浴，保温30 min，取出，冰水浴中5 min，静置[15-17]。在200～800 nm进行波长扫描。

2.1.2线性与范围

精密吸取100，125，150，175，200，225，250 μL母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，得葡萄糖稀释液。分别精密量取上述稀释液2 mL 于10 mL 具塞试管中，按2.1.1 项下方法处理。于490.5 nm 处测吸光度（A），以葡萄糖溶液浓度（C）为横坐标，以A值为纵坐标作标准曲线，得回归方程。

2.1.3精密度

精密量取120，170，220 μL 无水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀。分别精密量取上述稀释液2 mL于10 mL（具塞）试管中，按2.1.1项下方法处理，至常温后测值，于1 d内测定三次，计算日内精密度。

2.1.4回收率

精密量取120，170，220 μL 无水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀。分别精密量取上述稀释液2 mL于10 mL（具塞）试管中，按2.1.1项下方法处理，至常温后测值，计算回收率。

2.1.5稳定性

精密量取160 μL无水葡萄糖母液于10 mL容量瓶中，加水定容，摇匀，得葡萄糖稀释液。分别精密量取上述稀释液2 mL于10 mL具塞试管中，按2.1.1项下方法处理，至常温后，分别于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min测值。

2.1.6泸产养生酒总糖的测定

精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6适量置于容量瓶中，加入基酒定容，摇匀，得养身酒稀释液。精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀释液适量，置于具塞试管中，加双蒸水至2 mL，各加5%苯酚溶液（新制）1 mL，并迅速加入浓硫酸5.0 mL，立即摇匀，40 ℃水浴，保温30 min，取出，冰水浴中5 min，静置，至常温后测值。

2.2 总黄酮

2.2.1芦丁紫外吸收行为表征

精密称取40 mg 芦丁标准品于100 mL 容量瓶中，加水定容，得芦丁溶液（质量浓度为0.4 mg/mL）。取适量上述芦丁溶液于10 mL 具塞试管中，加80%乙醇溶液至5 mL，摇匀后加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，加入80%乙醇溶液至10 mL[18-19]。在200～800 nm进行波长扫描。

2.2.2线性与范围

精密量取0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40 mL 母液于10 mL试管中，按2.2.1项下方法处理。于509 nm处测吸光度（A），以芦丁溶液浓度（C）为横坐标，以A值为纵坐标作标准曲线，得回归方程。

2.2.3精密度

精密量取0.50，0.80，1.30 mL芦丁标准品溶液于10 mL试管中，按2.2.1项下方法处理，测值，于1 d内测定三次，计算日内精密度。

2.2.4回收率

精密量取0.50，0.80，1.30 mL芦丁标准品溶液于10 mL 试管中，按2.2.1 项下方法处理，测值，计算回收率。

2.2.5稳定性

精密量取母液于10 mL 试管中，按2.2.1 项下方法处理，分别于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min测值。

2.2.6泸产养生酒总黄酮的测定

精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6适量置于容量瓶中，加入基酒定容，摇匀，得养身酒稀释液。精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀释液适量，置于具塞试管中，加80%乙醇溶液至5 mL，摇匀后加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，静置6 min 后加入10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，加入80%乙醇溶液至10 mL，测值。

2.3 总多酚

2.3.1没食子酸紫外吸收行为表征

精密称取20 mg没食子酸标准品于100 mL容量瓶中，加水定容，得没食子酸溶液（质量浓度为0.2 mg/mL）。取适量上述没食子酸溶液于10 mL试管中，加超纯水至1 mL，摇匀，加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，加10 %碳酸钠溶液2.5 mL，摇匀，加超纯水2 mL，30 ℃水浴30 min，摇匀，静置[20-26]。在200～1 000 nm进行波长扫描。

2.3.2线性与范围

精密量取36，66，96，126，156，186 μL母液于10 mL试管中，按2.3.1项下方法处理。于769 nm处测吸光度（A），以没食子酸溶液浓度（C）为横坐标，以A值为纵坐标作标准曲线，得回归方程。

2.3.3精密度

精密量取42，102，180 μL母液于10 mL试管中，按2.3.1 项下方法处理，测值，于1 d 内测定三次，计算日内精密度。

2.3.4回收率

精密量取42，102，180 μL母液于10 mL试管中，按2.3.1项下方法处理，测值，计算回收率。

2.3.5稳定性

精密量取没食子酸母液于10 mL 试管中，按2.3.1 项下方法处理，于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min测值。

2.3.6泸产养生酒总多酚的测定

精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6适量置于容量瓶中，加入基酒定容，摇匀，得养身酒稀释液。精密量取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀释液适量，置于具塞试管中，加超纯水至1 mL 摇匀，加入0.5 mL 福林酚试剂，摇匀，加10%碳酸钠溶液2.5 mL，摇匀，加超纯水2 mL，30 ℃水浴30 min，摇匀，静置，测值。

3 结果

3.1 总糖测定方法的建立及应用

3.1.1紫外吸收行为表征

在200～800 nm对葡萄糖标准品溶液进行紫外全波长扫描。由图1可知，葡萄糖标准品溶液最大吸收波长为490.5 nm。

图1 葡萄糖的波长扫描

3.1.2线性范围

一系列的葡萄糖对照品储备液在490.5 nm处用紫外分光光度计测定吸光度，以药物浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数，由图2可见，葡萄糖标准品的线性回归方程为y=0.0612x-0.0238（R2=0.9999），在5.0～12.5 μg/mL 范围内具有良好的线性关系，且方程拟合参数显示线性拟合方法可靠。

图2 葡萄糖的标准曲线

3.1.3回收率和精密度

分别配制低、中、高浓度(6.0 μg/mL，8.5 μg/mL，11.0 μg/mL)的葡萄糖标准品溶液，依据对应的标准曲线计算实测药物浓度、相对回收率和日内精密度，由表1 可见，低、中、高浓度(6.0 μg/mL，8.5 μg/mL，11.0 μg/mL)的葡萄糖标准品溶液的回收率（%）分别为107.591、104.131、105.005，于80 %～120 %，符合分析方法的基本要求；日内精密度（RSD%）分别为0.500、1.143、1.404；均小于2%，符合分析方法的基本要求。

表1 葡萄糖的相对回收率和日间精密度

3.1.4稳定性

精密量取无水葡萄糖母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，得葡萄糖稀释液，于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min 测值，由表2 可见，在室温条件下，该显色方法480 min 内比较稳定，各样品吸光度的RSD为0.045%，小于2%，满足分析方法要求。

表2 葡萄糖标准品显色反应在室温480 min内稳定性

3.1.5泸产养生酒总糖的测定

取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀释液适量，置于具塞试管中，按2.1.6项下方法处理，测值。测得养生酒Y-3、Y-4、Y-5、Y-6 总糖含量分别为20.94、49.01、39.70、47.61 mg/mL。

3.2 总黄酮测定方法的建立及应用

3.2.1紫外吸收行为表征

在200～800 nm对芦丁标准品溶液进行紫外全波长扫描。由图3可知，芦丁标准品溶液最大吸收波长为509 nm。

图3 芦丁的波长扫描

3.2.2线性范围

一系列的芦丁对照品储备液在509 nm 处用紫外分光光度计测定吸光度，以药物浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数，由图4可见，芦丁标准品的线性回归方程为y=0.0128x+0.0029（R2=0.9992），在16.0～56.0 μg/mL 范围内具有良好的线性关系，且方程拟合参数显示线性拟合方法可靠。

图4 芦丁的标准曲线

3.2.3回收率和精密度

分别配制低、中、高浓度(20.0 μg/mL，36.0 μg/mL，52.0 μg/mL)的芦丁标准品溶液，依据对应的标准曲线计算实测药物浓度、相对回收率和日内精密度，由表3可见，低、中、高浓度(20.0 μg/mL，36.0 μg/mL，52.0 μg/mL)的芦丁标准品溶液的回收率（%）分别为98.085、100.027、100.560，于80%～120%，符合分析方法的基本要求；日内精密度（RSD %）分别为1.340、1.080、1.502；均小于2%，符合分析方法的基本要求。

表3 芦丁的相对回收率和日间精密度

3.2.4稳定性

精密量取芦丁母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，得芦丁稀释液,于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min测值，由表4 可见，在室温条件下，该显色方法480 min内比较稳定，各样品吸光度的RSD为0.365%，小于2%，满足分析方法要求。

表4 芦丁标准品显色反应在室温480 min内稳定性

3.2.5泸产养生酒总黄酮的测定

取养生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀释液适量，置于具塞试管中，按2.2.6项下方法处理，测值。测得养生酒Y-3、Y-4、Y-5、Y-6 总黄酮含量分别为69.58、50.41、292.92、387.45 μg/mL。

3.3 总多酚测定方法的建立及应用

3.3.1紫外吸收行为表征

在200～1 000 nm 对没食子酸标准品溶液进行紫外全波长扫描。由图5可知，没食子酸标准品溶液最大吸收波长为769 nm。

图5 没食子酸的波长扫描

3.3.2线性范围

一系列的没食子酸对照品储备液在769 nm 处用紫外分光光度计测定吸光度，以药物浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算得到线性回归方程和线性相关系数，由图6可见，没食子酸标准品的线性回归方程为y=0.1303x+0.0342(R2=0.999)，在1.2～6.2 μg/mL范围内具有良好的线性关系，且方程拟合参数显示线性拟合方法可靠。

图6 没食子酸的标准曲线

3.3.3回收率和精密度

分别配制低、中、高浓度(1.4 μg/mL，3.4 μg/mL，6.0 μg/mL)的没食子酸标准品溶液，依据对应的标准曲线计算实测药物浓度、相对回收率和日内精密度，由表5 可见，低、中、高浓度(1.4 μg/mL，3.4 μg/mL，6.0 μg/mL)的没食子酸标准品溶液的回收率（%）分别为94.714、102.118、99.833，于80%～120%，符合分析方法的基本要求；日内精密度（RSD%）分别为0.579、0.338、0.412；均小于2%，符合分析方法的基本要求。