柠檬提取物和水飞蓟素对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究

2021-06-13刘甜甜杨舒涵俸瑞璟

西南医科大学学报 2021年2期

刘甜甜，杨舒涵，颜梅，俸瑞璟，邓莉

（西南医科大学：1临床医学院临床医学专业；2口腔医学院口腔医学专业；3医学基础研究中心，四川泸州 646000）

随着生活水平的提高及受中国餐桌酒文化的影响，人们短期内急性大量饮酒、醉酒的情况时有发生，这对肝细胞有明显的毒害作用，易造成急性酒精性肝损伤，从而直接或间接导致酒精性肝病（alco⁃holic liver disease，ALD）的发生。ALD 早期常表现出脂肪肝等症状，若不及时加以控制，可发展成酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化，甚至导致肝功能衰竭；而在疾病的晚期，肝移植通常是唯一的解决办法[1-2]。目前临床上一般采取戒酒和给予药物来进行综合干预，但患者对戒酒的依从性较差，而许多相关的治疗药物毒副作用又较大[3]。故通过寻找解酒保肝成分来有效缓解酒精对肝脏的损害，早期控制对酒精性肝病具有重要意义。

柠檬含有丰富的柠檬烯、类黄酮化合物、维生素C、柠檬酸及多种微量元素，是一种营养和药用价值都很高的水果，具有抗氧化、消炎、抗癌、抗肿瘤、杀菌等生理活性功能。有资料[4-8]表明柠檬中含有的柠檬烯、类黄酮化合物及维生素C 等成分都单独对肝脏有一定保护作用，但是包含这些总成分的柠檬提取物对肝脏的作用效果如何却未见相关报道。而水飞蓟素是从水飞蓟果中提取的一种活性素，有清除活性氧，对抗脂质过氧化，促进肝细胞修复、再生等功能[9]，在临床上常被用于治疗慢性肝炎、肝硬化等疾病。考虑到ALD 发病机制复杂，各个影响因素之间相互关联，用单一药物治疗可能有一定局限性，猜想联合用药可能对ALD 有更好的疗效。因此，本研究对柠檬提取物和水飞蓟素单独或联合使用对急性酒精性肝损伤的干预效果进行观察，拟为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 成年大鼠45 只（200 ± 20 g），由西南医科大学动物实验中心提供并通过动物伦理审核。

1.2 药物及试剂

52度红星二锅头（北京红星酿酒股份有限公司，批号20180623）；柠檬提取物（西安派顿生物科技有限公司，产品规格10∶1）；水飞蓟素胶囊（德国马博士大药厂，批号20180521）；谷草转氨酶检测试剂盒（AST，批号20180605）、谷丙转氨酶检测试剂盒(ALT，批号20180615)、超氧化物歧化酶检测试剂盒(SOD，批号20180718)、丙二醛检测试剂盒(MDA，批号20180713)，均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司，型号DZKW-4），紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，型号UV752N）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，型号ELX808）。

1.4 动物分组与处理

造模参照王筱婧等[10]的模型及前期预实验，将实验动物随机分成5 组：空白组、模型组、水飞蓟素组、柠檬提取物组、联合组（水飞蓟素+柠檬提取物），每组9只。所有大鼠每日灌胃前禁食6 h，各组每天灌胃白酒或生理盐水两次（空白组每次按照0.5 mL/100 g 灌胃生理盐水，其余各组每次按照0.5 mL/100 g灌胃52度红星二锅头），两次间隔1 h。白酒或生理盐水灌胃后再间隔1 h，空白组和模型组按照1 mL/100 g 灌胃生理盐水，水飞蓟素组按照1 mL/100 g 灌胃水飞蓟素（水飞蓟素胶囊内粉末状药品用蒸馏水按0.02 g/mL稀释），柠檬提取物组按照1 mL/100 g灌胃柠檬提取物（采用0.5%吐温80 溶液按照0.6 g/mL配制[11]），联用组灌胃0.5 mL/100 g水飞蓟素+0.5 mL/100 g柠檬提取物。一共灌胃8 d。

1.5 指标检测及方法

1.5.1检测血清中ALT、AST含量

末次灌胃后禁食不禁水20 h（次日），用3%的戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，开胸，在大鼠心脏取血2 mL，血样室温静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存。按照试剂盒说明书操作，用赖氏法检测ALT、AST含量。

1.5.2计算肝脏系数及检测MDA含量、SOD活力

将取出的肝脏用电子天平称重，计算肝脏系数（计算公式：肝脏重量／体重×100%）。取肝左叶组织约0.5 g，剪碎，加入4.5 mL生理盐水制备成10%的肝匀浆，2 000 r/min离心15 min，重复3次，留取上清液，-20 ℃保存。按照试剂盒说明书操作，用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

1.5.3制备病理切片

在肝右叶同一部位，取一块肝组织，用4%多聚甲醛固定，将固定24 h后的肝组织进行石蜡包埋、切片（4 μm）、HE 染色处理。在光镜下观察肝组织细胞形态学变化，并观察脂滴在肝脏分布的面积和范围，对肝组织脂肪化进行评分。

1.6 统计分析

实验所得数据由SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD 法；单项有序的资料用等级秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中ALT、AST含量比较

如表1所示，与空白组相比，模型组大鼠血清中ALT、AST 含量均明显升高（P <0.05）。与模型组相比，水飞蓟素组、柠檬提取物组和联用组的大鼠血清中ALT、AST 含量均明显的下降（P <0.01）。与单独用柠檬提取物对大鼠进行干预相比，联合组大鼠血清中ALT、AST含量下降更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 大鼠血清中ALT、AST含量的变化（）

注：a与模型组相比，P<0.05；b与联用组相比，P<0.05

2.2 各组大鼠肝组织匀浆液中MDA 含量、SOD 活力比较

如表2所示，与空白组相比，模型组大鼠肝组织匀浆液中MDA 含量明显升高（P <0.05），SOD 活力明显降低（P<0.01）。与模型组相比，水飞蓟素组、联用组大鼠肝组织匀浆液中MDA 含量降低（P <0.05）；联用组大鼠肝组织匀浆液中SOD 活力升高（P<0.05）。与联用组相比，水飞蓟素组、柠檬提取物组大鼠肝组织匀浆液中MDA含量、SOD活力变化无统计学意义（P>0.05）。

表2 大鼠肝组织匀浆液中MDA含量、SOD活力的变化（）

注：a与模型组相比，P<0.05。

2.3 各组大鼠肝脏系数比较

如表3所示，与空白组相比，模型组大鼠的肝脏重量未见显著变化，而体重明显下降（P<0.05），肝脏系数明显增加（P<0.05）。与模型组相比，水飞蓟素组、柠檬提取物组和联用组的动物体重增加（P<0.05），肝脏系数明显下降（P<0.05），联用组与两个单独干预组之间的肝脏系数差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠肝脏系数的变化（）

注：a与模型组相比，P<0.05。

2.4 各组大鼠肝组织病理学变化情况

如图1所示：空白组肝脏被膜完整，肝索排列整齐，门管区结构未见明显纤维组织增生，亦未见明显炎性细胞浸润。其余各组均出现不同程度的肝细胞空泡变性、脂肪变性，表现为胞质内出现数量不等和大小不等的微小空泡状或细小颗粒状物质。对大鼠肝组织进行脂肪变性评级，标准参考文献[12]。经秩和检验分析结果如表4 所示，不同组间肝细胞脂肪变性程度有所不同，差异具有统计学意义（U=76.5，62.5，60，69；P=0.001，0.039，0.065，0.007）与空白组相比，模型组肝细胞脂肪变性程度加重。与模型组相比，水飞蓟素组、联用组肝细胞脂肪变性程度有所减轻；联用组的肝细胞变性程度与两个单独干预组相比无差异。

表4 大鼠肝组织病理学变化

图1 ↘肝细胞脂肪变性

3 讨论

肝脏是人体酒精代谢的主要器官，但肝脏的代谢能力是有限的。一般而言，2周内有暴饮史(乙醇量≥80 g/d)或超过5 年平均男性乙醇量≥40 g/d，女性乙醇量≥20 g/d（乙醇量（g）换算公式=饮酒量（mL）×乙醇含量（%）×0.8），即可造成酒精性肝损伤，增加酒精性肝病(ALD)发病风险[13]。

谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）是存在于肝脏中的酶，在肝细胞受损及膜通透性增加的情况下，会从肝脏溢出到血清，且在血清中的含量与肝脏受损程度呈正比[14]，能很好反映肝细胞膜稳定性[15]；肝组织病理切片能较直观地观察肝细胞变性坏死、肝索排列等情况，从而反映肝脏的损伤程度。本研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清AST、ALT水平升高，肝细胞发生脂肪变性，且指标变化都有统计学意义，提示急性酒精中毒模型建立成功。而相比于模型组，各干预组的AST、ALT含量都有显著的下降，病理切片示肝细胞脂肪变性程度有所减轻，表明柠檬提取物和水飞蓟素能稳定肝细胞膜，减轻肝组织病变，缓解酒精对肝脏的损伤。

ALD 受多个相互关联的因素影响，发病机制复杂，而氧化应激及其诱发的脂质过氧化对疾病的发生发展起着关键作用[16]。机体活性氧簇主要是通过细胞色素P450-2E1(CYP2E1)诱导产生，在正常情况下，细胞内存在活性氧清除剂，可以清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤。但是大量饮酒导致CYP2E1活性增强，使活性氧产生增加，抗氧化物质被大量消耗，体内的氧化-抗氧化机制失去平衡，引发氧化应激导致DNA、蛋白质等分子的氧化损伤，从而影响细胞呼吸功能及ATP 生成，导致肝细胞坏死或凋亡[17-18]。而过量的氧自由基也会导致线粒体及肝细胞等部位的生物膜脂质过氧化，从而诱导炎细胞浸润，激活Kupffer细胞和肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)，促使肝脏纤维化的发生[19]；还会破坏膜结构和通透性，影响其功能，如线粒体受损会使肝细胞对脂肪酸的分解功能降低，引起肝细胞脂肪堆积[20]。超氧化物歧化酶(SOD)是活性氧清除剂，其活力高低可以反映机体清除氧自由基的能力；丙二醛(MDA)是脂质过氧化产物，其含量可衡量肝脏脂质过氧化程度。在本次实验结果中，对比空白组，模型组大鼠的肝脏MDA 水平升高、SOD 活性下降，进一步提示实验造模成功。用柠檬提取物进行干预后，柠檬提取物组大鼠的MDA 含量降低、SOD 活性增加，但与模型组相比，差异无统计学意义。而联用水飞蓟素时，联用组的MDA水平降低、SOD活性升高（P<0.05），提示单独应用柠檬提取物对肝脏的保护作用较弱，而柠檬提取物和水飞蓟素联合应用在减少酒精对人体的影响、保护肝脏方面有一定的协同作用，其机制可能与增强氧自由基的清除，抑制超氧阴离子毒性，减轻氧化应激及脂质过氧化有关。

肝脏系数是毒理实验常用指标，其值的变化可以粗略反映肝脏的病变类型，如系数增大表明肝脏可能脂肪变性或增生肥大，反之则表明肝脏萎缩或其他退行性改变[21]。与模型组相比，模型组的肝脏系数值虽比干预组大（P<0.01），但分析数据发现：干预组与模型组间的大鼠肝脏重量差异无统计学意义，肝脏系数有显著差异是由体重变化导致的。推测此现象是因为酒精影响大鼠的食欲或消化吸收，使大鼠体重明显下降，且此次实验周期短，实验可能在肝脏重量没有下降或下降趋势不明显时已结束，故肝脏重量差异无统计学意义。