迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间品质与蛋白特性变化影响

蓝蔚青，张 溪，赵盼盼，仇炜麟，迪丽菲拉·库尔班，谢 晶

（1.上海海洋大学食品学院// 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心// 3.上海海洋大学食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海 201306）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又名太平洋白虾、南美白对虾，是全球重要的海水养殖经济虾类[1]，其味道鲜美，体内富含多不饱和脂肪酸与氨基酸等多种营养物质[2]。据2020 年中国渔业统计年鉴[3]显示，我国凡纳滨对虾海水养殖产量为111.75 万t，占虾类海水养殖产量77%以上。但虾类等水产品在流通期间由于受微生物与内源酶影响，极易发生腐败，因而采用合适的处理手段延长其货架期意义重大。目前，虾类的常用保鲜方法有物理保鲜、化学保鲜与生物保鲜等[4]。近年来，随着消费者对食品安全重视程度的逐年增加，生物保鲜由于其绿色安全而受到研究人员的关注。

生物保鲜剂，又称为天然保鲜剂，其取材广泛，是从动、植物和微生物中提取的安全、健康、无毒，具有保鲜效果的一类食品添加剂。其中，植物提取物具有抗氧化和抗菌活性，作为潜在的天然添加剂越来越受到人们重视。迷迭香（Rosmarinus officinalis）属唇形科草本植物，含有鼠尾草酸，迷迭香醇、迷迭香醌、迷迭香二酚、肉桂醇与肉桂酸等多种抗氧化成分[5]。迷迭香提取物的抗氧化和抗菌活性主要归因于肌酸和肌醇，其含有酚类二萜化合物，可稳定不饱和脂肪酸，延缓其降解，因此被应用于水产品和肉制品中[6]。其中，王强等[7]研究发现迷迭香提取物对鲊广椒肉丸中的微生物生长有较好的抑制作用；张楠楠等[8]采用2 g/L 迷迭香提取物与 1 g/L ε-聚赖氨酸复配处理大黄鱼（Pseudosciaena crocea），能使其冰藏货架期由6～9 d 延至13～ 15 d。目前，生物保鲜剂用于虾类保鲜研究主要集中在葡萄籽提取物[9]与石榴皮提取物[10]等，而迷迭香提取物用于凡纳滨对虾保鲜研究报道尚少。基于此，本研究主要探究不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间品质变化影响，通过菌落总数、理化（pH 值、总挥发性盐基氮TVB-N值、硫代巴比妥酸TBA 值、质构分析TPA 值）与蛋白特性（总巯基含量、蛋白荧光强度）指标，结合色差、黑变指数与感官分析，综合评价其冷藏期间的品质变化，以期为生物保鲜剂在虾类水产品中的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要药品试剂

三氯乙酸、乙醇、氯化钠、氧化镁，购于国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂，购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；总巯基测定试剂盒，购于南京建成生物科技有限公司；硼酸、甲基红、溴甲酚绿、三羟甲基氨基甲烷、顺丁烯二酸，购于生工生物工程（上海）股份有限公司等，均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

Kjeltec8400 型凯氏定氮仪，瑞典FOSS 公司；H-2050R 型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TA.XT Plus 质构仪，英国Stable Micro System 公司。

1.3 原料处理

凡纳滨对虾（L.vannamei）购于上海市浦东新区尚优鲜生超市，选取体长（14±1）cm、体质量（16±1）g，体表无损且大小均一的活虾。将虾置于充氧气运输箱中保活，30 min 内运输至实验室。用碎冰使其休克失活，清水洗净沥干后随机分成4组，分别用无菌水（CON），质量分数2.0%、4.0%、6.0%迷迭香提取物溶液浸渍处理10 min，虾水质量比为1∶2，自然沥干15 min 后，装入保鲜袋于（4±1）℃冰箱中，每2 d 测定各项指标。

1.4 实验方法

1.4.1菌落总数（Total Viable Counts，TVC）参考GB 4789.2-2016[11]方法测定菌落总数。称取5 g虾肉放入盛有45 mL 质量分数0.85%无菌生理盐水的无菌均质袋中，均质后梯度稀释。采用倾注倒平板法，在30 ℃恒温培养箱中培养48 h 后计数，结果以菌落总数对数值表示。

1.4.2理化指标

1.4.2.1pH 值 参考GB 5009.237-2016[12]方法测定pH 值。将虾肉与蒸馏水按质量比1∶9 混匀后，静置30 min，用pH 计测定。

1.4.2.2总挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）据GB 5009.228-2016[13]中的自动凯氏定氮仪法，测定各组样品贮藏期间的TVB-N 值。

1.4.2.3硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid，TBA）参考Ge 等[14]方法，称取5 g 虾肉，将其与体积分数20%三氯乙酸溶液25 mL 混合后均质1 min，8000 r/min 离心10 min，取上清液定容至50 mL 后摇匀。取5 mL 上述溶液，与5 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸液混匀后，沸水反应20 min，流水冷却至室温，吸取显色溶液测定其在532 nm 处的光密度值D，按照TBA 值=7.8×D计算TBA 值，单位为mg/kg。

1.4.2.4质构分析（Texture Profile Analysis，TPA）参考Liu 等[15]方法稍作修改，取虾腹部第二节肌肉，采用直径6 mm 的平底圆柱形探头如下：测试前速率为4 mm/s，测试时速率为1 mm/s，测试后速率为5 mm/s，压缩形变率为50%，两次下压间隔时间为5.0 s，触发值大小为15 g。记录每组样品在不同贮藏时间下的硬度值与弹性值。

1.4.3蛋白特性

1.4.3.1总巯基含量 按总巯基含量测定试剂盒说明书，采用分光光度法测定412 nm 处光密度值。分子消光系数取13 600 L/(mol·cm)。

1.4.3.2内源荧光强度 参考Li 等[16]的方法提取肌原纤维蛋白。取2 g 虾肉与20 mL 缓冲液（20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.05 mol/L KCl）匀浆，以10 000 r/min、4 ℃离心15 min，留下层沉淀与20 mL 缓冲液（20 mmol/L Tris-maleate，pH 7.0，0.6 mol/L KCl）均质，在4 ℃条件下静置提取1 h。将混合物于10 000 r/min 4 ℃离心15 min，上清液为肌原纤维蛋白溶液，并存放在0～ 4 ℃条件下1 h内备用。提取肌原纤维蛋白溶液进行内源荧光高速扫描检测，采集参数如下：激发波长为295 nm；发射波长为300～ 400 nm；扫描速度为1 200 nm/min，狭缝宽度为5 nm。

1.4.4色差 根据汪春玲等[17]法，用白色校准板校准色差计后，测第二腹节虾肉表面的亮度值L*、红度值a*与黄度值b*。

1.4.5黑变指数 根据Kim 等[18]法，采用表1 的评分标准，由6 名经过专业培训的人员分别对不同组别样品的黑变情况予以评分。其分值越小，代表其新鲜度越高。

表1 凡纳滨对虾黑变评分标准Table 1 Evaluation criteria for Litopenaeus vannamei

1.4.6感官评价 参考Azizi-lalabadi 等[19]法采用9分制评定凡纳滨对虾的总体可接受度。由6 名经过专业训练的人员组成感官评定小组，整体评分根据色泽、气味与质地等方面对样品予以感官评价。将样品分为四个等级：为坏或不可接受（1～ 3 分）、好（4～ 6 分）、非常好（7～ 8 分）、优秀（9 分）。

1.5 数据处理

所有实验均重复3 次，数据统计分析采用SPSS17.0 软件，作图采用Origin85 软件，采用单因素方差分析，显著性水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 菌落总数

凡纳滨对虾在不同迷迭香提取物作用下，其冷藏过程中的菌落总数变化如图1 所示。

由图1 可知，CON 组和RE 处理组的菌落总数随着贮藏时间的增加呈上升趋势。CON 组的菌落总数初始对数值为2.67±0.09，经过整个贮藏期后菌落总数对数值达到7.56±0.08。与CON 组贮藏8 d菌落总数相比，RE 处理组菌落总数均显著降低（P＜0.05），降低数在0.41～ 1.75。而RE1 组和RE2样品的菌落总数在整个贮藏期内，菌落总数对数值始终未超过7。其中以RE3 的菌落总数值最低，可见，质量分数4.0%与6.0%迷迭香提取物浸渍处理对凡纳滨对虾贮藏过程的菌落总数有明显的抑制作用。该结果与Nawaz 等[20]研究的迷迭香提取物对印鲮（Cirrhinus mrigala）保鲜结果变化一致。Hussein 等[21]报道迷迭香提取物可延缓鸡肉片冷藏期间嗜冷菌生长和生物胺的升高。

图1 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间菌落总数变化影响Fig.1 Effects of different treatments on TVC of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage

2.2 pH 值和TVB-N 值

虾肉中的总挥发性盐基氮是指蛋白质在微生物和酶作用下分解为氨和胺类等碱性化合物[22]。不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间pH 值和TVB-N 值变化影响如图2 所示。

由图2A 可知，各组的pH 值随着贮藏时间的延长呈上升趋势，可能与挥发性碱性化合物的积累有关[23]。与CON 组相比，RE2 和RE3 组在贮藏初期的pH 值增加较缓。Gao 等[24]研究发现迷迭香提取物可减缓鸡胸肉贮藏期间pH 值上升，这与本研究结果一致。这可能与迷迭香提取物抑制腐败菌生长，减少胺类物质的产生有关；另一方面原因是迷迭香提取物中含有鼠尾草酸、迷迭香酸、咖啡酸、熊果酸等酚酸类化合物，对pH 值升高有较好的抑制作用[25]。

从图2B 可知，随着冷藏时间的延长，各处理组的TVB-N 值呈增加趋势。贮藏2 d，无菌水与RE 处理组的TVB-N 值相近，分别为（11.15±0.73）、（10.01±0.55）、(8.98±0.23)、（8.76±0.49）mg/100g。从4 d 起，各处理组样品TVB-N 值差异性显著（P＜0.05），各组虾样中TVB-N 值的增长速率从大到小依次为CON 组＞RE1 组＞RE2 组＞RE3 组。对照组样品的TVB-N 值上升速度明显快于RE 处理组。样品在贮藏6 d 时，CON 组的TVB-N含量值为（32.66±0.36）mg/100g，已超过腐败限值（30 mg/100 g），而RE1，RE2 和RE3 组的TVB-N值分别为（27.78±0.55）、（24.05±0.51）、（21.90±0.66）mg/100 g。结果表明浸渍质量分数4%和6%的迷迭香提取物保鲜效果较好，这是因为迷迭香提取物处理能在一定程度上抑制虾肉中的微生物生长，降低蛋白质分解速率，减少含氮类化合物累积。

图2 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间pH 值和TVB-N 值变化影响Fig.2 Effects of different treatments on pH and TVB-N value of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

2.3 TBA 值和总巯基含量

虾肉中的不饱和脂肪酸氧化是导致异味产生的主要原因之一。TBA 值是评价脂肪氧化程度的重要指标，氧化程度越高，表明产生的醛酮类等氧化产物越多。

图3A 可知，不同迷迭香提取物浓度处理的凡纳滨对虾TBA 值总体呈上升趋势。贮藏前期，不同处理方式对凡纳滨对虾TBA 值差异不显著（P＞0.05），随着贮藏时间的延长，其差异显著（P＜0.05）。CON 组TBA 初始值为0.029 mg/kg，贮藏8 d 时为0.69 mg/kg，而RE1、RE2 和RE3 组分别比CON 组TBA 值低15.9%、24.6%和20.3%。这可能是因为迷迭香提取物的抗氧化性，降低了脂肪氧化速率，减少不饱和脂肪酸氧化产物的产生。Jafari等[26]研究发现迷迭香提取物中的鼠尾草酸可提供酚基氢，导致形成稳定的最终产物并改变自由基链。由于迷迭香提取物中含鼠尾草酸、迷迭香酚等具有较强的螯合金属离子能力，能有效稳定自由基，从而抑制虾肉的脂肪氧化[27]。

图3 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间TBA值和总巯基含量变化影响Fig.3 Effects of different treatments on TBA valueand total sulfhydryl content of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei)during refrigerated storage

总巯基含量是反映蛋白被氧化程度的指标之一。图3B 可知，在冷藏8 d 期间，各组样品总巯基含量不断下降，这是由于蛋白分子内部的活性巯基被暴露而氧化导致。随着迷迭香提取物浓度的增加而下降速度减慢（P＜ 0.05），表明迷迭香提取物延缓虾肉肌原纤维蛋白氧化。0 d，凡纳滨对虾的总巯基质量摩尔浓度为（2.15±0.04）μmol/g，RE1、RE2和RE3 组样品冷藏8 d 分别降低至（1.12±0.07）、（1.24±0.05）、（1.32±0.03）和（1.42±0.04）μmol/g。Nie 等[28]探究冷藏期间海鲈鱼（Lateolabrax japonicas）肌肉中总巯基的含量变化与本研究结果一致，可能归因于巯基氧化为二硫键，导致总巯基含量减少。CON 组样品与处理组相比，其差异显著（P＜0.05）。由此可见，迷迭香提取物可抑制样品贮藏期间的蛋白质氧化。

2.4 质构分析

如图4 所示，不同处理凡纳滨对虾在冷藏期间硬度呈下降趋势，8 d 时，与新鲜样品的初始硬度值（897.12±8.72）相比（图4A），CON、RE1、RE2 和RE3 组样品的硬度分别降至新鲜样品的28.01%、48.38%、52.24%和50.66%。可能是虾肉中的蛋白质降解和汁液损失导致肌原纤维蛋白结构改变[29]。弹性表示虾肉因外力作用而变形、撤外力后恢复的速率。各组样品弹性值（图4B）随着冷藏时间的延长而逐渐减少，这是因为微生物和内源性蛋白酶作用导致肌肉组织结构韧性降低[30]。与CON 组相比，RE2 和RE3 组样品下降幅度较小，这与Lan等[31]研究迷迭香提取物对冰藏大黄鱼的弹性变化趋势相一致。表明迷迭香提取物可延缓虾肉中的蛋白质降解速率，稳定其肌肉组织结构。

图4 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间硬度值和弹性值变化影响Fig.4 Effects of different treatments on hardness and springiness value of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

2.5 内源荧光光谱

色氨酸残基具有荧光特性，其吸收紫外光而发射的荧光对周围微环境的极性非常敏感[32]。蛋白质折叠时，色氨酸残基位于蛋白质内部疏水环境，被激发后发射较高的荧光强度；蛋白质完全或部分展开时，当色氨酸残基暴露于蛋白质表面，被激发后荧光强度降低。因此，可监测内源荧光强度来研究蛋白构象变化[33]。

由图5 可知，新鲜样品的荧光强度最高，发射波长为334 nm 处的荧光强度最大。随着贮藏时间的延长，氨基酸的天然排列方式发生改变，内源色氨酸残基逐渐暴露于极性环境中，荧光强度下降。与CON 组相比，RE1、RE2 和RE3 组样品的内源荧光强度下降幅度较小，说明迷迭香提取物可维持样品贮藏期间蛋白质三级结构稳定。Shi 等[34]研究发现迷迭香上釉提取物对泥虾（Solenoceramelantho）蛋白质结构有保护作用。

图5 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾肌原纤维蛋白冷藏期间荧光强度变化影响Fig.5 Effects of different treatments on intrinsic fluorescence intensity (IFI) of myofibrillar proteins of white leg shrimp(Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage.

2.6 色差

色泽是消费者肉眼评判水产品鲜度的直观依据[35]。图6 表示不同处理方式对冷藏凡纳滨对虾肌肉L*值、a*值和b*值变化影响。

由图6A 可知，样品的L*值随着贮藏时间延长而降低，表明其肌肉亮度下降。与CON 组样品相比，不同浓度迷迭香提取物处理能延缓L*值降低，较好稳定其色泽，这与Huang 等[36]研究迷迭香提取物提高猪肉糜亮度一致。不同处理方式样品a*值（图6B）总体呈上升趋势，可能是因为虾体多酚氧化酶作用下导致其黑变，使虾体色泽变深。CON 组a*值在贮藏末期达到正值，显著高于RE 处理组。由此说明，迷迭香提取物能延缓样品a*值升高，质量分数4.0%和6.0%迷迭香提取物浸渍处理效果最佳。样品b*值（图6C）随着贮藏时间的延长而上升，RE3 组由于提取物自身颜色影响，使其b*值升高明显，而RE2 组样品处理浓度较低，对虾肉在贮藏期间的色泽无负面影响，能在延长其冷藏货架期的同时，维持其体表色泽稳定。

图6 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间色差变化影响Fig.6 Effects of different treatments on color difference of white leg shrimp (Litopenaeus vannamei) during refrigerated storage

2.7 黑变值和感官评分

由于多酚氧化酶催化用，无色酚类物质被氧化为醌，发生一系列生化反应生成黑色物质[37]。

如图7A 所示，各组样品在冷藏期间的黑变分值均显著增加（P＜ 0.05）。与CON 组样品相比，迷迭香提取物处理能延缓虾体黑变。其中，RE2 和RE3 组样品黑变评分显著低于RE1 组。由图可知，CON 和RE1 组的虾样头胸部分别在2 d 和4 d 开始出现黑斑，而RE2 和RE3 组在6 d 出现黑斑。

如图7B 所示，凡纳滨对虾在贮藏期间感官评分逐渐降低，表明凡纳滨对虾的品质不断下降。RE2组样品在贮藏期间的感官分值高于其他处理组，与对照组相比差异性显著（P＜0.05），且在外观，风味方面表现出更好的品质特征。由此表明，在提取物质量分数为4%时，其感官评分最佳，如浓度升高则其感官分值相应降低。Hao 等[38]发现，添加迷迭香提取物处理能有效维持鲍鱼（Haliotis discusHannai Ino）良好的感官品质。

图7 不同浓度迷迭香提取物对凡纳滨对虾冷藏期间黑变指数和感官变化影响Fig.7 Effects of different treatments on melanosis and sensory score of Litopenaeus vannamei during refrigerated storage

3 结论

迷迭香提取物浸渍处理能明显抑制凡纳滨对虾冷藏期间的微生物生长速度，减缓其pH 值、TVB-N 值与TBA 值的上升速率，使虾肉保持良好的硬度与弹性值，降低蛋白质氧化速率，维持样品贮藏期间蛋白质三级结构的稳定性，保持体表色泽稳定。其中，以浸渍质量分数4.0%迷迭香提取物保鲜作用效果最佳。与对照组相比，凡纳滨对虾经该浓度浸渍处理后，能使其冷藏货架期延长2～ 3 d。