马氏珠母贝酶解蛋白粉营养组成及其对斑马鱼学习记忆能力的影响

魏 伟，朱国萍,2，章超桦,2，高加龙,2，曹文红,2，郑惠娜,2，秦小明,2

（1.广东海洋大学食品科技学院// 2.广东省水产品加工与安全重点实验室// 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室// 国家贝类加工技术研发分中心(湛江)，广东 湛江 524088）

学习记忆能力的基础是神经元的突触可塑性。随着全球老龄化的加剧，与学习记忆相关的脑健康问题愈发凸显，导致家庭与社会的负担日益加重[1]。衰老过程中促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 等长期刺激可导致慢性、低度、微炎性等炎性衰老状态[2]。相关研究表明，衰老可触发激活脑部的免疫细胞——小胶质细胞分泌促炎症细胞因子，炎性衰老状态损伤神经元突触结构长时程增强，从而引起学习记忆能力衰退甚至导致神经退行性疾病[3-5]。Mcgeer等[6]发现，通过抑制慢性炎症反应可以改善由衰老引起的学习记忆能力衰退，进而提升老年人的生活质量。

马氏珠母贝（Pinctada martensii）是我国海水珍珠养殖的主要品种，主要分布于日本和我国南海沿岸，其营养丰富，产量巨大，是一种尚待开发的海洋资源[7]。据报道，马氏珠母贝酶解产物具有抗衰老[8]、抗炎[9]、增强免疫[10]、抗氧化[11]、抗疲劳[12]等多种生物活性。但是关于马氏珠母贝酶解产物改善学习记忆能力的功效研究报道较少。本研究通过分析马氏珠母贝酶解蛋白粉营养组成，以自然衰老斑马鱼作为动物模型，饲喂马氏珠母贝酶解蛋白粉，比较其T 迷宫行为学以及生物指标的变化，探究马氏珠母贝酶解蛋白粉对衰老斑马鱼（Daniorerio）空间学习记忆能力的改善作用，旨在为马氏珠母贝酶解蛋白粉改善老年记忆功能衰退的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物

马氏珠母贝酶解蛋白粉（Enzymolysis protein powder ofPinctada martensii，EPP），广东海洋大学食品科技学院预制酶解蛋白粉。

6 月龄和18 月龄的斑马鱼，体长分别为2.5～3.0 cm、2.8～ 3.3 cm，购于上海乙诺水族科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

BCA 蛋白质定量试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；斑马鱼白细胞介素1β（IL-Iβ）试剂盒，（批号20190702-95471A）、斑马鱼肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒（批号20190702-95472A）、斑马鱼白细胞介素 10（IL-I0）试剂盒（批号：20190702-96083A）、斑马鱼脑源性神经营养因子（BDNF）试剂盒（批号：20190702-98030A），江苏酶免实业有限公司。

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、盐酸、硼酸、苯酚、无水葡萄糖、石油醚等试剂均为分析纯。

SZF-06A 脂肪测定仪，上海洪纪仪器设备有限公司；组织研磨仪，卡尤迪生物科技有限公司；SL1-700 恒温孵育箱，上海爱朗仪器有限公司；Multiskan FC 酶标仪，美国 Thermo 公司；ZEBRALAB 鱼类高通量实验监控系统，法国Viewpoint life sciences 公司；T 型迷宫，法国Viewpoint life sciences 公司。

1.3 方法

1.3.1马氏珠母贝酶解蛋白粉的制备 采用课题组预制马氏珠母贝酶解蛋白粉进行实验。酶解工艺条件参照课题组前期优化条件[13]。

1.3.2马氏珠母贝酶解蛋白粉基本营养成分的测定 水分测定采用常压干燥法按GB 5009.3—2016测定；灰分测定采用高温灼烧法按GB 5009.4—2016 测定；粗蛋白质测定采用凯氏定氮法按GB 5009.5—2016 测定；粗脂肪测定采用索氏抽提法按GB 5009.6—2016 测定；总糖测定采用苯酚-硫酸法按GB/T 9695.31—2008 测定。

1.3.3马氏珠母贝酶解蛋白粉氨基酸组成测定氨基酸组成采用氨基酸分析仪按GB5009.124—2016 测定。

1.3.4马氏珠母贝酶解蛋白粉金属含量测定 钙、铁、锌、硒、铜、锰含量测定采用微波消解-电感耦合等离子体-质谱法按GB 5009.268—2016 测定。

1.3.5实验动物分组及给药 所有的斑马鱼置于14 h 光照/10 h 黑暗的循环中（光照阶段从7：00 am开始），控制温度（25±2）℃、空气湿度（60±5）%，养殖用水是曝晒两周后的自来水。不同年龄段的斑马鱼被盛于不同的长方形水箱（35 cm×24 cm×20 cm）中，水箱配备过滤、温控装置，密度1.5 尾/L。

将40 尾18 月龄斑马鱼随机分成两组，每组20尾。另取20 尾6 月龄斑马鱼作为对照。分为对照组（6 月龄饲料喂养）、模型组（18 月龄饲料喂养）、实验组（18 月龄饲料按3.0 g/kg 剂量拌喂EPP）3组。适应性喂养两周（14 d）后，进行连续分组饲养30 d，每天一次。实验组EPP 饲喂量参照《保健食品检验与评价技术规范（2003 年版）》[14]按人体推荐剂量20 倍，3.0 g/kg 进行实验。

1.3.6斑马鱼T 迷宫试验 参照葡韵竹[15]的方法并适当改进。本试验所用 T 型迷宫由水平等长的左右臂和垂直辅道组成。材料均为白色不透明的塑料板，以避免外界颜色对斑马鱼行为学产生影响。在测试期，T 迷宫与ZEBRALAB 鱼类高通量实验监控系统联合使用。该试验分适应期与测试期两个阶段，为期5 d，试验期间不喂食。

行为学适应期在实验开始的31 d 上午9 点开始进行。将整组斑马鱼轻缓地放入T 迷宫中适应2 h，并保证这段时间内右臂一直有食物存在，以给予斑马鱼奖赏刺激，形成记忆。适应期未有数据。

行为学测试期从实验开始的32 d 上午9 点开始进行。每组斑马鱼20 尾，逐尾进行测试。在转移斑马鱼的过程中，实验人员应尽量动作温柔轻缓，以免对行为学结果产生影响。并且每尾待测鱼在测试前需在安静无干扰环境放置5 min 作预处理。在测试期间，斑马鱼在迷宫中的运动由带有红外检测功能的摄像机监控，摄像机位于迷宫正上方1.5 m处，并连接在一台计算机上，便于实验人员观察斑马鱼的运动。

测试时，将准备好的斑马鱼放入垂直辅道起点处，并开始5 min 计时。当斑马鱼进入右臂，并且持续时间大于或等于30 s 时，即认为这尾斑马鱼成功进入食物放置区，此时在右臂对斑马鱼进行食物奖赏，斑马鱼从放入起点到进入右臂的时间为潜伏期；若斑马鱼未成功进入右臂，计时结束后引导其进入右臂投喂食物，停留3 min，使斑马鱼将右臂与食物奖励形成联系，其潜伏期计为300 s。每条鱼测试结束后，系统自动导出斑马鱼运动轨迹，可用于计算右臂游动路程占比。

测试结束后，将斑马鱼放到提前备好的鱼缸中，进行下一条鱼的测试。当整组鱼测试结束后，一起放回原来的水箱。

行为学测试每天一次，持续4 d。在剔除不游动的斑马鱼后，统计斑马鱼进入食物放置区（右臂）的成功率、潜伏时间、右臂游动路程占比。

1.3.7脑组织样本的制备 将完成行为学试验的斑马鱼于次日上午在冰水混合物中低温麻醉后称重，按顺序放置于冰面上，用眼科镊打开被固定斑马鱼的头盖后，完整将全脑取出，将鱼脑分析天平称重并记录，盛装于预先备好的离心管，为保证样品量3 个斑马鱼脑组织作为一个样品（n=6，其余两个鱼脑组织用作试剂盒浓度预实验），在液氮中急冻后，放于-80 ℃冰箱，用于后续指标测定。

将冻存的鱼脑解冻后，按照质量体积比1∶9加入磷酸盐缓冲液（pH=7.4）后，进行组织匀浆，匀浆液在3 000 r·min-1，4 ℃条件下离心10 min，取上清，转移至新离心管后，冻存于-80 ℃冰箱，备后续生物化学指标测定。

1.3.8斑马鱼脑组织炎症因子及神经营养因子测定 采用斑马鱼IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF 试剂盒测定鱼脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF含量，具体操作严格参照说明书。采用BCA 蛋白质定量试剂盒测定实验样品蛋白含量，具体操作严格参照说明书。

1.4 数据统计分析

实验数据除行为学结果外均以平均值±标准差表示，行为学结果以平均值±标准误差表示。采用独立样本t检验对数据进行组间差异显著性分析，行为学成功率采用卡方检验进行比较。显著水平α=0.05。采用JMP Pro 13 进行数据分析，Origin Pro 9.0 作图。

2 结果与分析

2.1 EPP 基本营养组成分析

EPP 基本营养组成见表1，EPP 粗蛋白质量分数高达78.28%，粗脂肪质量分数1.96%，总糖质量分数3.88%，水分质量分数5.87%，灰分质量分数11.59%。同水解牡蛎(Crassostrea rivularis)粉（粗蛋白52.40%、粗脂肪1.09%、总糖12.00%、水分14.20%、灰分17.20%）[16]相比，具有高蛋白特点。

表1 马氏珠母贝酶解蛋白粉的基本营养组成Table 1 Contents of basic component in EPP %

2.2 EPP 氨基酸组成分析

对EPP 氨基酸进行分析，结果见表2。结果显示EPP 氨基酸种类齐全，含量丰富。尤其是天冬氨酸、谷氨酸质量分数（以蛋白粉为基础）很高，分别达到8.87、13.00%，两者占总氨基酸比例28.21%，均高于牡蛎酶解产物含量[17]。EPP 的主要氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、精氨酸。EPP的疏水性氨基酸质量分数为28.39%，疏水性氨基酸占总氨基酸比例为36.62%，高于牡蛎酶解产物组分（31.04%）[18]。

表2 马氏珠母贝酶解蛋白粉的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of EPP %

2.3 EPP 金属元素含量分析

EPP 金属含量测定结果见表3，所测定的金属元素（以蛋白粉为基础）中Ca 质量分数最高，达725.54 mg/kg，占全部测定元素的86.32%。EPP 除Ca 含量很高外，还含有较高的Fe 和Zn 元素，质量分数分别为55.80、48.71 mg/kg，以上3 种元素占全部测定元素的98.75%。另外EPP 还含有较低量的锰、铜、硒元素，质量分数分别为5.16、3.14、2.19 mg/kg。

表3 马氏珠母贝酶解蛋白粉的金属元素含量Table 3 Metal element content of EPP mg/kg

2.4 EPP 对斑马鱼体质量的影响

在实验动物生长发育期，体质量的增长情况是反映动物健康状况最基本的指标之一[19]。因此可通过测量比较实验后斑马鱼的质量对EPP 进行初步食用安全性评价。

各组斑马鱼体质量见图1，经比较，各组斑马鱼体质量无显著差异（P＞0.05）。各组斑马鱼体质量分别为：对照组（0.52±0.09）g、模型组（0.54±0.13）g、实验组（0.59±0.12）g。这初步表明，EPP 对斑马鱼的正常生长无影响，是一种安全的海洋食品原料。

图1 马氏珠母贝酶解蛋白粉对斑马鱼体质量的影响Fig.1 Effect of EPP on the body weight in zebrafish

2.5 EPP 对斑马鱼行为学的影响

T 迷宫试验结果见图2。总体而言，从行为学测试开始，对照组、模型组、实验组斑马鱼的觅食成功率、潜伏期、右臂游动路程占比在3、4 d 均趋于稳定和一致，这可能是因为行为学测试过程中对斑马鱼记忆的巩固强化所致，因此在接下来分析中中仅描述和讨论1～ 2 d 的行为学结果。与对照组相比，模型组1～ 2 d 成功率未有显著差异（P＞0.05）；与模型组相比，实验组1、2 d 成功率均显著升高（P＜0.05）（图a）。与对照组相比，模型组潜伏期1、2 d 略高（P＞0.05）；与模型组相比，实验组潜伏期明显降低（P＞0.05）（图b）。与对照组相比，模型组右臂游动路程占比1、2 d 未有显著差异（P＞0.05）；与模型组相比，实验组占比1、2 d 均显著升高（P＜0.05）（图c）。行为学结果表明，实验组斑马鱼学习记忆能力强于模型组。综上所述，EPP可以有效改善自然衰老斑马鱼的学习记忆能力。

图2 马氏珠母贝酶解蛋白粉对斑马鱼行为学的影响Fig.2 The effects of EPP on zebrafish behavioristics

2.6 EPP 对斑马鱼脑组织炎症因子含量的影响

EPP 对斑马鱼脑组织炎症因子含量的影响见表4，与对照组相比，模型组斑马鱼脑组织IL-1β、TNF-α 含量显著上升（P＜0.05），表明衰老导致了斑马鱼脑部炎症反应的增强；与模型组相比，实验组斑马鱼脑组织IL-1β、TNF-α 含量显著下降（P＜0.05），说明EPP 能够抑制促炎细胞因子的产生，具有显著的体内抗炎作用，表明EPP 对衰老斑马鱼学习记忆能力的改善作用可能与其抑制神经炎症有关。另外，各组斑马鱼脑组织中IL-10 含量均无显著差异（P＞0.05），但可见模型组斑马鱼脑组织IL-10 含量较高。

表4 马氏珠母贝酶解蛋白粉对斑马鱼脑组织炎症因子质量分数的影响Table 4 Effects of EPP on the content of inflammatory factors in zebrafish brain tissue pg/mg

2.7 EPP 对斑马鱼脑组织脑源性神经营养因子含量的影响

EPP对斑马鱼脑组织BDNF含量的影响见图3，与对照组相比，模型组斑马鱼脑组织中BDNF 的含量无显著变化（P＞0.05）；与模型组相比，实验组斑马鱼脑组织中BDNF 含量显著升高（P＜0.05）。各组斑马鱼脑组织BDNF 质量分数别为：对照组（389.18±37.38）、模型组（392.39±26.89）、实验组（447.38±48.32）pg/mg。这表明，EPP 可以提高自然衰老斑马鱼脑组织中的BDNF 含量。

图3 马氏珠母贝酶解蛋白粉对斑马鱼脑组织BDNF含量的影响Fig.3 Effect of EPP on the content of BDNF in zebrafish brain tissue

3 讨论

学习记忆能力会受到衰老的显著影响，是最先衰退的认知功能之一[20]。衰老伴随的自由基氧化会通过促进神经细胞内炎症小体的形成、诱导MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）磷酸化、活化NF-κB（调节促炎细胞因子分泌的核转录因子），导致大脑慢性炎症，进而损伤宿主的学习记忆能力[21-23]。本研究结果表明，EPP 中蛋白质量分数高达78.28%，经酶解后，含有大量的低分子肽。氨基酸测定结果表明，EPP 含有丰富的酸性氨基酸（Glu、Asp）和疏水性氨基酸，分别占总氨基酸的28.21%、36.62%。酸性氨基酸可作为氢供体中和自由基的氧化性；疏水性氨基酸可提高小分子肽在体内水-脂界面的溶解度，提升抗氧化能力，EPP 可能通过抗氧化途径抑制炎症反应、提高学习记忆能力[24]。另外，金属元素含量测定结果表明，EPP 含有丰富的Ca、Fe、Zn 元素。金属元素在人体中主要以酶辅基或直接参与的形式影响包括学习记忆在内的所有生命活动，孙艳等[25]研究发现Zn 预处理可以降低LPS 诱导的小胶质细胞炎症，补充Zn 可能对学习记忆有改善作用。从EPP 的营养组成来看，其可能具有通过抗氧化途径或直接作用改善大脑炎症状况，提升学习记忆能力的功效。

衰老会导致包括斑马鱼在内的脊椎动物学习记忆能力下降，且衰老斑马鱼学习记忆能力的衰退可通过行为学试验进行评估[26-27]。T 迷宫是从啮齿类动物向斑马鱼学习记忆研究工具转化的经典范例，其在简单的设备和较少的学习成本条件下即可评估斑马鱼的学习记忆能力[28]。在迷宫试验中，予以斑马鱼食物奖励刺激是常用的刺激方式之一[29]。本研究采用T 迷宫行为学方法，分析斑马鱼的觅食成功率、潜伏期、右臂游动路程占比以评估斑马鱼的学习记忆能力。结果显示，与对照组相比，模型组斑马鱼觅食成功率偏低而潜伏期偏高，呈现出学习记忆能力的损伤趋势；与模型组相比，实验组斑马鱼在行为学测试期1～ 2 d 的觅食成功率（P＜0.05）、右臂游动路程占比（P＜0.05）、潜伏期表现全面提升，表明EPP 可以明显改善自然衰老斑马鱼的学习记忆能力。

学习与记忆的基础是突触可塑性，包括新突触的形成、神经元重塑、新神经元的生成[30]。突触可塑性衰退的中心活动是中枢神经系统的免疫激活，即神经炎症[31]。小胶质细胞是一种存在于脑组织的主要免疫细胞，衰老条件下会发生活化，激活的小胶质细胞可以极化为两种不同的表型：M1 型和M2型[32]。M1 型极化是一种有害表型，其特征在于促炎因子（IL-1β、TNF-α 等）的高表达，反映脑组织炎症状况。IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子，可直接抑制LTP（引起突触可塑性改变的主要形式），造成记忆能力下降[33]，对神经细胞的发育和存活产生不利影响[34]；IL-1β、TNF-α 也可能通过降低BDNF表达量，损伤学习记忆能力[30,35]。M2 型极化是一种有益表型，其特征在于BDNF 和抑炎因子（IL-10等）的表达[32]，BDNF 是一种广泛存在于大脑的蛋白质，与神经再生、空间学习和记忆相关，可以通过诱发LTP、促进神经元发育和存活而影响记忆的形成，与神经元的突触可塑性呈正相关[33,36]。IL-10是一种抗炎细胞因子，可以促进神经细胞增殖，降低其它促炎细胞因子水平。本研究结果显示，与对照组相比，模型组斑马鱼脑组织中IL-1β、TNF-α含量均显著上升（P＜0.05）、BDNF 含量无明显差异；在EPP 饲喂后，与模型组相比，实验组斑马鱼脑组织中的IL-1β、TNF-α 含量均显著下降（P＜0.05）、BDNF 含量显著升高（P＜0.05）。表明EPP对神经炎症有抑制作用，其可通过缓解神经炎症、提高BDNF 含量来改善衰老斑马鱼学习记忆能力。斑马鱼脑组织IL-10 含量各组之间的差异并不显著（P＞0.05），但模型组斑马鱼脑组织中IL-10、BDNF含量的相对增加，表示斑马鱼大脑可能因衰老而触发的适应性机制，自身会通过适当的抗炎反应来补偿炎症水平的加剧。Song 等[37]的研究也表现出斑马鱼在逆环境中的IL-10 和BDNF 上升。值得注意的是，虽然与对照组相比，模型组斑马鱼脑组织中的IL-1β、TNF-α 含量显著升高，但是与对照组相比，模型组斑马鱼并未表现出更差的行为学结果，这可能是由于6 月龄和18 月龄斑马鱼对环境变化的不同敏感程度造成的。Remy 等[38]对环境富集条件下青年和衰老斑马鱼的行为学进行研究，所得结果与本研究一致。

EPP 改善自然衰老斑马鱼学习记忆能力的功效可能是基于酶解产生的肽类物质或者包括金属元素在内的其它组分，也可能是所有成分共同作用的结果。其改善学习记忆的物质基础还需进一步探究，另外，本研究虽在参考文献基础上采用EPP 3.0 g/(kg·d) 的饲喂剂量，发现EPP 具有改善自然衰老斑马鱼学习记忆能力的功效，但是其具体的量效关系仍然未知。因此，在本研究基础上，对不同剂量的EPP 分离组分改善衰老斑马鱼学习记忆能力的探讨将作为下一步工作的重点。

4 结论

EPP 是一种高蛋白、氨基酸种类齐全，富含金属元素的优质海洋食品原料。饲喂EPP 30 d 后，自然衰老斑马鱼进入T 迷宫右臂的成功率、潜伏期及右臂游动路程占比均有明显改善，脑组织中IL-1β、TNF-α 含量显著降低，BDNF 含量升高。表明EPP 具有改善自然衰老斑马鱼学习记忆能力的功效，其机制可能与EPP 缓解斑马鱼脑组织炎症状况、提高脑源性神经营养因子水平有关。