山西老陈醋熏醅中类黑精提取工艺优化

郑丹丹，韩凯，石嗣中，王如福*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.山西农业大学 园艺学院，山西 晋中 030801)

山西老陈醋以其独特的酿造工艺和酸爽醇厚的风味位于我国四大名醋之首，不仅是人们日常生活中风味优良的调味佳品，而且具有祛湿防病、软化血管、美容健体等功效。其“蒸、酵、熏、淋、晒”酿造工艺已被列入国家级非物质文化遗产，熏醅是其酿造工艺的精华之一[1-2]，醋醅在热的作用下由原先的浅棕色变为棕褐色，主要是由于美拉德反应后期产生了大量类黑精。类黑精是一种良好的天然抗氧化剂，除了赋予老陈醋特殊色泽及风味的同时，还具有抗肿瘤、抗炎、抑菌、降糖、降脂、降压等功能特性，但对其活性机理尚不明确，还有待进一步研究。目前，在调味品等食品行业中，由于市售调味品中抗氧化剂大多是合成的且具有一定危害性，因而类黑精作为天然抗氧化剂的研究及应用在调味品等食品行业具有很广阔的前景[3]。高效的提取分离方法是对类黑精深入研究的前提。

超声-微波协同提取法是近年来将微波的电磁能和超声波的机械振荡效果相结合的一种新兴辅助提取技术，具有提取率高、提取时间短、能耗低等优势，目前已广泛应用于天然活性物质的提取[4-5]，由于光波的迅速致热比只用微波有更高的加热温度，更有助于类黑精的提取，且未见超声-微波-光波组合对熏醅中类黑精提取的文献报道。本研究采用超声-微波-光波协同提取熏醅中类黑精，并通过响应面法确定最佳提取条件，以期为山西老陈醋熏醅中类黑精的深入研究提供理论依据，并为类黑精的开发应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山西老陈醋熏醅：参照GB/T 19777-2013《地理标志产品 山西老陈醋》中的酿造工艺制成；蒸馏水(均为国产分析纯)。

1.2 仪器与设备

FA224电子天平、722型可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；超声波清洗机、SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；CG-8220多功能研磨机 中山市长柏电器实业有限公司；KDC-140HR高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器有限公司；GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；79-1型磁力加热搅拌器、THZ-82恒温振荡水浴锅 常州润华电器有限公司；G70F20CN1L-DG(B0)格兰仕微波炉 广东格兰仕微波生活电器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山西老陈醋熏醅中类黑精的提取

山西老陈醋熏醅→粉碎(至粒径为0.2～0.4 mm)→超声-微波-光波协同提取→离心(25 ℃，10000 r/min，20 min)→浓缩滤液→醇沉(4倍体积无水乙醇)→静置(4 ℃，24 h)→离心(25 ℃，10000 r/min，10 min)→冷冻干燥→山西老陈醋熏醅中类黑精提取物。

1.3.2 类黑精提取量的测定方法

采用分光光度法测定，按式(1)计算。

类黑精提取量=A420×V。

(1)

A420值与类黑精含量呈正相关[6-7]。式中：A420为类黑精提取液在420 nm处的吸光值；V为相对体积比倍数或料液比倍数。

1.4 单因素试验设计

按照1.3.2所述方法提取山西老陈醋熏醅中类黑精，探究液料比、超声温度、超声时间、微波-光波组合方式、微波-光波时间对熏醅中类黑精提取量的影响。准确称取熏醅5.00 g，液料比分别为10，20，30，40，50，60，70 (mL/g)；超声温度分别为20，30，40，50，60，70，80 ℃；超声时间分别为0，10，20，30，40，50，60 min；微波-光波组合方式分别为100%光波、30%微波+70%光波、55%微波+45%光波、100%微波；微波-光波时间分别为0，1，2，3，4，5，6，7 min。固定单因素条件液料比为40 (mL/g)，超声温度为60 ℃，超声时间为30 min，微波-光波组合方式为55%微波+45%光波，微波-光波时间为4 min。

1.5 响应面试验设计

根据上述单因素试验结果，运用Box-Benhnken设计原理进行响应面试验设计，以类黑精提取量(AV值)为响应值，固定微波-光波组合方式为55%微波+45%光波，以液料比、超声温度、超声时间、微波-光波时间为自变量，分别考察各自变量对响应值的影响并对提取条件进行优化。响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计

1.6 提取率与提取级数测定

在确定类黑精最佳提取条件下，多次浸提5.00 g熏醅，直至最后类黑精提取液吸光度小于0.02，分别收集各次提取液吸光度Ai并测体积Vi；最后合并各次提取液，得到总体积V与总吸光度A，计算各次提取率，确定提取级数，类黑精提取率按式(2)计算。

类黑精提取率=AiVi/AV×100%。

(2)

1.7 不同提取方法比较

准确称取4份熏醅5.00 g，其提取工艺同1.3.2，并按照以下提取条件对4种提取方法进行比较，每个试验重复3次。

水浴提取：液料比34 (mL/g)、水浴温度67 ℃、水浴时间1.0 h。

超声波辅助提取：液料比34 (mL/g)、超声温度67 ℃、超声时间28 min。

微波-光波辅助提取：液料比34 (mL/g)、微波-光波总功率700 W、微波-光波组合方式为55%微波+44%光波、微波-光波时间6 min。

超声-微波-光波协同提取：料液比34 (mL/g)、超声温度67 ℃、超声时间28 min、微波-光波总功率700 W、微波-光波组合方式为55%微波+44%光波、微波-光波时间6 min。

2 结果与分析

2.1 液料比对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

由图1可知，随着液料比的增加，熏醅中类黑精提取量呈先升高后下降的趋势，当液料比为30 (mL/g)时，熏醅中类黑精提取量达到最高，之后继续增大液料比，类黑精提取量反而下降，这是因为提取剂用量是类黑精提取中很好的推动力，适宜浓度差可起到良好的提取效果[8]。在一定范围内增加提取剂用量可影响固相主体与液相主体间的浓度差，有助于提高溶剂扩散率和传质速率，但当提取剂量过高时，相同时间提供的热量被提取剂吸收的比例增加，空化效应和机械效应等强度减弱，影响类黑精提取效率，并且浸出的类黑精对未浸出产物有一定抑制作用，提取完全所需时间也相应延长[9]。综合考虑后续的浓缩操作和耗能成本等因素，选择液料比(mL/g)为20，30，40 作为后续响应面分析的3个水平。

图1 液料比对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

2.2 超声温度对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

由图2可知，类黑精提取量随着超声温度的升高呈先增大后减小的趋势，当超声温度为70 ℃时类黑精提取量达到最大，这是因为随着超声温度适当升高，分子运动速度加快，从而使熏醅渗透扩散速度加快，有利于熏醅中类黑精溶出，但超声温度过高时，会导致部分类黑精结构不稳定而易分解，同时增加了溶液中杂质的溶出量，使类黑精提取量降低。由此选择超声温度为60，70，80 ℃作为后续响应面分析的3个水平。

图2 超声温度对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

2.3 超声时间对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

由图3可知，超声时间在0～60 min内，熏醅中类黑精提取量呈先上升后下降的趋势，当超声时间为30 min时类黑精提取量出现峰值。随着超声时间的增加，由于超声的空化效应、热效应及机械作用，使熏醅中类黑精充分与提取剂接触，类黑精提取量随之增大，但超声时间过长，提取剂易挥发，导致部分类黑精结构不稳定而易分解，或使其他非类黑精聚合物溶出，使类黑精提取量下降[10]。因此，选择超声时间20，30，40 min作为后续响应面分析的3个水平。

图3 超声时间对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

2.4 微波-光波组合方式对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

由图4可知，4种微波-光波组合方式(微波-光波总功率为700 W)对熏醅中类黑精提取量的影响由强到弱依次为：55%微波+45%光波>100%微波>30%微波+70%光波>100%光波，这是因为光波加热是由外向内靠热辐射对物质进行加热；而微波加热是由内向外靠穿透物质，使其内部分子产生振动和摩擦，进而对物质加热，且加热极其迅速。然而微波-光波组合处理时，光波迅速致热比只用微波有更高的加热温度，配合微波的内加热与分子搅拌功能，进而加快了熏醅中类黑精溶出[11-12]。因此，后续响应面设计微波-光波组合方式为55%微波+45%光波最佳。

图4 微波-光波组合方式对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

2.5 微波-光波时间对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

由图5可知，随着微波-光波时间逐渐增加，熏醅中类黑精提取量呈先升高后下降的趋势，当微波-光波时间为6 min时，类黑精提取量达到最大。但当微波-光波时间延长到7 min时，类黑精提取量略有下降，但差异不显著(P>0.05)，这可能因为随着微波-光波时间的逐渐增加，微波和光波对熏醅组织不断破坏，使熏醅中类黑精不断溶出，但增加到一定时间后，类黑精提取量达到最大，再持续加热易引起溶液局部温度过高，破坏类黑精结构并使其分解，进而使类黑精提取量逐渐下降[13-14]。综合考虑能耗成本等因素，选择微波-光波时间为4，5，6 min 作为后续响应面分析的3个水平。

图5 微波-光波时间对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的影响

2.6 响应面试验设计与结果

由表2可知，山西老陈醋熏醅中类黑精提取量对液料比(A)、超声温度(B)、超声时间(C)和微波-光波时间(D)的二次多项回归模型为:

表2 响应面分析方案与结果

山西老陈醋熏醅中类黑精提取量(AV值)=268.68+7.54A-14.75B-2.30C+33.92D-4.41AB-4.47AC+4.03AD-4.13BC-1.58BD-4.00CD-18.54A2-32.78B2-14.68C2-12.46D2。

由表3可知，P<0.0001，表明回归模型极显著；失拟项P=0.4529>0.05，表明失拟不显著，选用的回归模型是适当的；决定系数R2=0.9933，则试验结果与模型预测结果具有良好一致性；校正系数RAdj2=0.9866，说明试验结果有98.66%受试验因素影响。因此，响应面试验结果可靠，此模型可对试验结果进行分析和预测。

表3 回归模型及方差分析

回归模型中F值可判断出各因素对响应值的影响，各因素对熏醅中类黑精提取量影响的大小顺序为：D>B>A>C，即微波-光波时间对熏醅中类黑精提取量的影响程度最大。一次项中A，B，D的影响是极显著的(P<0.01)，C的影响是显著的(P<0.05)；二次项中A2、B2、C2、D2的影响均达到极显著水平(P<0.01)；交互项中AB、AC、AD、BC、CD的影响是显著的(P<0.05)，而BD的影响是不显著的(P>0.05)，这表明各因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

2.7 响应面交互作用分析

根据回归模型绘出的3D曲面图和等高线图，可直接观察出各因素与响应值间的关系及两两因素间的交互作用，3D曲面图越陡，等高线越接近椭圆，说明两因素间的交互作用越显著[15]。由图6可知，AB、AC、AD、BC、CD的交互作用显著(P<0.05)，BD间的交互作用不显著(P>0.05)，该结果与方差分析结果一致。

图6 各因素交互作用对山西老陈醋熏醅中类黑精提取量的响应曲面图和等高线图

2.8 确定最佳提取条件与验证回归模型

结合回归模型分析，超声-微波-光波协同提取山西老陈醋熏醅中类黑精的最佳工艺条件为：液料比33.924(mL/g)、超声温度67.217 ℃、超声时间28.407 min、微波-光波组合方式为55%微波+45%光波、微波-光波时间5.915 min，此提取条件下熏醅中类黑精提取量预测值为293.959。考虑到实际操作的可行性，将以上提取条件修正为：液料比34 (mL/g)、超声温度67 ℃、超声时间28 min、微波-光波组合方式为55%微波+45%光波、微波-光波时间6 min。在此提取条件下进行3次平行试验，得到熏醅中类黑精提取量为290.856±1.738，与预测值相差1.06%，结果表明，该回归方程模型优化得到的熏醅中类黑精提取工艺参数准确可靠，具有一定实际应用价值。

2.9 最佳提取级数的确定

在类黑精最佳提取条件下，多次浸提熏醅试样，按1.6的方法计算不同级数的类黑精提取率。

由表4可知，随着提取级数的增加，熏醅中类黑精提取量逐渐增大，经2次提取后类黑精提取率已达92.03%，提取较为完全，因而山西老陈醋熏醅中类黑精最佳提取级数为2级。

表4 提取级数对提取效果的影响

2.10 不同提取方法的比较

由表5可知，超声-微波-光波协同提取熏醅中类黑精显著高于其他3种方法(P<0.05)，超声-微波-光波协同提取与单一的水浴提取、超声波辅助提取和微波-光波辅助提取相比，类黑精提取量分别提高了201.64%、158.81%和83.67%。与其他3种方法相比，超声-微波-光波协同提取可在短时间内利用微波热效应和超声波空化作用，再加上光波的迅速致热，加快了熏醅中类黑精的溶出，具有一定的推广应用价值。

表5 4种提取方法的比较

3 结论

本试验采用响应面法对山西老陈醋熏醅中类黑精提取工艺进行优化，最终确定了超声-微波-光波协同提取法的最佳提取条件为：液料比34 (mL/g)，超声温度67 ℃，超声时间28 min，微波-光波组合方式为55%微波+45%光波，微波-光波时间6 min，提取级数2级，在此最佳提取条件下，熏醅中类黑精提取量(AV值)为290.856±1.738，与预测值相差1.06%，与单一的水浴提取、超声波辅助提取和微波-光波辅助提取相比，类黑精提取量分别提高了201.64%、158.81%和83.67%。超声-微波-光波协同提取法不仅操作简便、结果可靠，还具有高效、节能、无污染等优点，具有一定的理论意义及应用价值。熏醅中类黑精赋予了山西老陈醋色泽、香气及功能成分，但其活性机理尚不明确，试验采用超声-微波-光波协同提取法高效提取类黑精，为山西老陈醋熏醅中类黑精的深入研究提供了技术依据，同时在调味品等食品行业，对类黑精作为天然抗氧化剂的开发应用具有一定实践意义。